NLRP3 inflammasome as a target to reduce epileptiform activity in organotypic slices

Tese de mestrado, Neurociências, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2018A epilepsia é uma doença do foro neurológico caracterizada pela predisposição duradoura para gerar crises epilépticas. Cada crise é uma perturbação transitória da atividade neuronal que se torna síncrona e excessiva, interrompendo, momentaneamente, a função normal do cérebro. Calcula-se que, em Portugal, 1 em cada 200 pessoas tenha esta disfunção do sistema neurológico. Não existe cura para a epilepsia, no entanto, existem fármacos antiepilépticos (FAEs) que previnem a ocorrência de crises epilépticas. Os FAEs são prescritos de acordo com o tipo de epilepsia e com os fatores individuais de cada pessoa. Por vezes são necessárias várias tentativas e/ou politerapia para encontrar a medicamentação adequada para controlar as crises. Contudo nem todas as pessoas reagem aos FAEs. Estima-se que 30-40% das pessoas em todo o mundo sofrem de epilepsia refratária, ou seja, não têm a doença controlada. Uma vez que a epilepsia refratária pode ser incapacitante em algumas vertentes pessoais e profissionais e existe um elevado número de pessoas a sofrer desta doença, é necessário uma melhor compreensão da epilepsia e do processo de epileptogénese. Este processo é responsável por tornar um cérebro normal num cérebro com atividade neuronal anormal. Além disso, também é imprescindível testar novas terapias antiepileptogénicas que possibilitem uma melhor qualidade de vida a estes doentes. A maioria dos FAEs modula os mecanismos excitatórios e inibitórios relacionados direta ou indiretamente com a neurotransmissão. No entanto, tem havido um crescente interesse no estudo de moléculas/ fármacos anti-inflamatórios como terapias antiepileptogénicas. Além dos neurónios, as células gliais, ou seja, os astrócitos e a microglia, têm um papel importante no processo de epileptogénese. Estas células gliais estão envolvidas no processo de neuroinflamação produzindo diversas citocinas e outras moléculas que irão potenciar a inflamação. Atualmente sabe-se que existe um circuito positivo entre a epilepsia e a inflamação. A atividade epiléptica promove a libertação de fatores inflamatórios e a inflamação, por sua vez, potencia a atividade epiléptica. Uma das citocinas pro-inflamatórias mais estudada no âmbito da epilepsia é a interleucina-1β (IL-1β). Estudos recentes demonstraram que a expressão desta molécula está aumentada em modelos animais de epilepsia, bem como em pacientes com esta patologia. A IL-1β é produzida por um complexo multiproteico associado à imunidade inata denominado de inflamassoma NLRP3. Este complexo é ativado na presença de agentes patogénicos ou perigosos ao organismo, tais como os lipopolissacarídeos (LPS) e a adenosina trifosfato (ATP). Os LPS são moléculas que estão presentes na membrana exterior de bactérias gram-negativas, enquanto o ATP é uma molécula que transporta energia e é essencial às células. Ao ser ativado, o inflamassoma NLRP3 promove a clivagem da pro-IL-1β (forma inativa) em IL-1β, através da ativação da capase-1. Na forma ativa, a IL-1β sai da célula e promove a inflamação nas células vizinhas. Diversos estudos têm-se focado na modulação do mecanismo de ação desta interleucina, através de anticorpos anti-IL-1β ou através de antagonistas do seu recetor. Medicamentos que contêm substâncias como Anacinra (antagonista do recetor humano da interleucina-1) ou Canacinumab (anticorpo anti-IL-1β monoclonal totalmente humanizado) têm sido amplamente utilizados no tratamento de doenças relacionadas com o inflamassoma NLRP3, tal como a artrite reumatóide. No entanto, até 2016 ainda nenhum destes medicamentos tinha sido testado em doentes epilépticos. Casos clínicos reportados recentemente têm demonstrado a eficácia destes medicamentos em doentes com epilepsia refratária. Até então, apenas se tinham realizado estudos com substâncias similares em modelos animais. Adicionalmente, também foram desenvolvidos estudos para inibir a caspase-1, que tiveram sucesso na supressão de atividade epiléptica em modelos animais, mas não foram aprovados nos ensaios clínicos, ficando apenas na fase II. O presente estudo teve como principal objetivo modular a ativação do inflamassoma NLRP3 e avaliar o impacto na atividade epiléptica de fatias organotípicas. As fatias organotípicas são um ótimo modelo ex vivo, uma vez que preservam a arquitetura tridimensional, as conexões neuronais e as interações entre os neurónios e células gliais, por longos períodos. Além disso, também permitem testar potenciais fármacos de modo mais rápido, menos doloroso e menos dispendioso do que aconteceria em modelos animais. Inicialmente foi estabelecido o modelo de ativação do inflamassoma NLRP3 em fatias organotípicas de hipocampo e córtex preparadas a partir dos cérebros de ratos Sprague-Dawley com 6/7 dias de vida, por exposição a diferentes concentrações de LPS (5, 10 e 20ng/mL) durante 3 e 6h ou a LPS (10ng/mL) e ATP (1mM) simultaneamente. Após uma pré-incubação apenas com LPS durante 3h, o ATP foi co-incubado com o LPS durante mais 3h. De modo a escolher a melhor condição de ativação do inflamassoma, estudou-se a expressão proteica da αII-espectrina, para avaliar a morte celular, de componentes do inflamassoma (NLRP3 e ASC), e de marcadores das células gliais (Iba1 e GFAP). Adicionalmente foram quantificados, no tecido e no meio de cultura, os níveis de duas citocinas pro-inflamatórias: a IL-1β e os Fatores de Necrose Tumoral Alfa (TNF-α). Verificou-se que a exposição das fatias organotípicas ao LPS/ATP promoveu a diminuição de necrose, bem como a potenciação da libertação de citocinas para o meio extracelular. Uma vez que estes processos são característicos da ativação do inflamassoma, optou-se por utilizar esta condição. Posteriormente foi verificado o efeito da ativação do inflamassoma, pelo LPS/ATP, nas células gliais e na atividade epileptiforme. Através da técnica de imunohistoquímica foi possível observar a migração da microglia em direção ao meio de cultura. Na presença de LPS/ATP, a secção da fatia mais próxima do meio de cultura apresentava maior densidade celular, relativamente ao controlo, e maior ativação da microglia. Estas características correspondem a um processo de microgliose. Uma vez que existia elevada produção de IL-1β e microgliose nas fatias expostas a LPS/ATP antecipou-se um aumento na atividade epileptiforme nestas fatias. No entanto, tal não foi observado. As fatias expostas aos ativadores do inflamassoma apresentaram um número de bursts por fatia e características intrínsecas dos bursts semelhantes aos observados em fatias controlo. Os bursts são conjuntos de atividade neuronal excessiva que representam a fase ictal (correspondente à crise epiléptica). Após uma avaliação cuidada verificou-se que as fatias controlo, não sujeitas à adição de fármacos, exibiam uma elevada atividade epileptiforme. As fatias denominadas controlo neste estudo sofreram apenas uma mudança do meio de cultura, processo este que já havia sido descrito por diversos estudos. Durante os primeiros 14 dias in vitro, as fatias foram cultivadas num meio que continha soro de cavalo (meio Opti-MEM). Como este soro não é quimicamente definido, ou seja, varia de lote para lote, o meio de cultura foi alterado para um meio sem soro (meio Neurobasal A) no dia antes da adição dos fármacos. No entanto, verificou-se que as fatias controlo apresentavam claramente mais atividade epiléptica, que as fatias cultivadas sempre em meio Opti-MEM. Posteriormente foi avaliado o impacto da inibição do inflamassoma NLRP3 na produção da IL-1β e na microgliose, uma vez que tinham sido potenciadas na presença de LPS/ATP. De modo a inibir o inflamassoma, utilizou-se um inibidor seletivo deste complexo multiproteico denominado de MCC950 (10μM). Na presença dos ativadores do inflamassoma, o MCC950 não foi capaz de reverter a libertação da citocina pro-inflamatória nem a microgliose. Por estudos electrofisiológicos verificou-se que na presença dos ativadores do inflamassoma, o MCC950 não foi capaz de reverter a atividade neuronal excessiva. No entanto, quando o MCC950 foi incubado sozinho, observou-se uma clara diminuição da atividade ictal nas fatias organotípicas. Conclui-se que a atividade epileptiforme induzida nas fatias organotípicas pela mudança do meio de cultura era dependente do inflamassoma, dado que foi revertida por incubação com o seu inibidor. Em suma, os nossos resultados demonstram que o inflamassoma NLRP3 está relacionado com a indução e potenciação da atividade epileptiforme. Adicionalmente, também sugerem que o MCC950 é um potencial agente terapêutico para a epilepsia e que o inflamassoma NLRP3 deve continuar a ser meticulosamente estudado como potencial alvo terapêutico para a epilepsia.Extensive evidence has supported the involvement of neuroinflammation in epileptic seizures. Recently, analysis of serum blood samples of epileptic patients revealed an increased production of several pro-inflammatory cytokines, namely interleukin-1β (IL-1β).This protein is produced by NLRP3 inflammasome, a cytosolic multiprotein complex involved in innate immune response. The canonic activation of NLRP3 inflammasome involves a priming signal (as lipopolysaccharides – LPS), which upregulates the expression of NLRP3 and pro-IL1β; and an activating signal (as adenosine triphosphate – ATP), which promotes the assembly of the complex. The goals of this study were to enhance epileptiform activity of organotypic slices through LPS/ATP – activated NLRP3 inflammasome and to reduce this activity by selectively inhibiting the inflammasome. Organotypic cortex-hippocampus slices of Sprague-Dawley rats with 6/7 days were exposed to different LPS concentrations (5, 10, 20ng/mL) at 3 or 6h or LPS (10ng/mL) plus ATP (1mM) to choose the best condition to activate the NLRP3 inflammasome. In order to inhibit the inflammasome, a selective inhibitor, MCC950 (10μM), was added 1h before co-incubation with LPS and ATP. Negative controls with each compound alone were carried out in some assays. Regarding inflammasome activation, LPS and ATP together decreased necrosis (assessed by ratio SBDP120/α-IISpectrin) and potentiated the release of pro-inflammatory cytokines (interleukin-1β (IL-1β) and tumor necrosis factor α). These events are characteristics of NLRP3 inflammasome activation. Expression of inflammasome components (NLRP3 e ASC) and glial cells markers (Iba1 e GFAP) were also evaluated, but did not show differences. In LPS/ATP presence, slices presented microgliosis in the layers near the culture medium. However, they depicted a similar epileptiform activity when compared with control slices, which were not exposed to drugs. In this study was possible to verify that control slices, that only underwent culture medium exchange, had an exacerbated synchronous neuronal activity, when compared with slices that did not undergo this process. In slices treated with MCC950 in the presence of LPS/ATP, neither IL-1β release nor microgliosis were reversed by MCC950. Moreover, NLRP3 inflammasome inhibitor did not affect epileptiform activity in the presence of LPS/ATP. Nevertheless, when MCC950 was incubated alone, the epileptiform activity was dramatically reduced. That is, MCC950 reversed the epileptiform activity induced by medium exchange, suggesting that this process involved the NLRP3 inflammasome. Our findings demonstrate the important role of NLRP3 inflammasome in the promotion of epileptiform activity and begin to unravel a potential target for antiepileptic therapy