Genetic variations in the human growth hormone receptor gene: functional relevance and associations with short stature and obesity

The GH/IGF-1 axis plays an important role in the acquisition of longitudinal height but also in regulating fat metabolism. GH exerts its effects through specific binding to its receptor, the GH receptor (GHR), on target cells and activating multiple signaling pathways, leading to changes in cell gene expression and function. Any dysregulation in this axis can lead to pathophysiological consequences. For example, it is well known that a dysfunctional GHR protein leads to the Laron syndrome, characterized by proportional short stature and increased abdominal fat. Idiopathic short stature (ISS), a less drastic phenotype, occurs in 1-2% of the human population and is characterized by an average height >2 SD below the mean but a normal endocrine profile. The etiology of this phenotype is still unknown; however, the fact that a high percentage of these individuals have slightly elevated levels of serum GH and lower IGF-1 suggests decreased GH sensitivity. Recent GWAS studies have shown an association of the GHR gene as well as other members of the GH/IGF-1 axis with variation in height in the Caucasian population but these studies have rarely included the extreme tails of height distribution observed in ISS. The GHR gene structure is characterized by a unique 5' promoter organization. It comprises thirteen different first exons that produce transcripts that are either ubiquitously expressed or with a tissue- and developmental-specific expression pattern; however, all of the mRNAs code for the same protein. Previous studies in our lab found transcription factor-related functional mechanisms that regulate the expression of several of these transcripts. In addition, a GT microsatellite, located in the promoter of one major GHR transcript was shown to be polymorphic in the human population but its functional significance had not yet been characterized.For my PhD project, I hypothesized that different genetic variants within the GHR gene - a set of SNPs and the GT microsatellite – would be associated with ISS and SS phenotypes and that these associations would be influenced by adiposity indices, such as body mass index (BMI). I also hypothesized that the variants would have a regulatory effect on GHR transcription. Through a series of logistic regression analyses, I found sex-related associations of specific GT repeat genotypes and one SNP in intron 2 with Caucasian ISS pediatric cohorts (Chapter II). Moreover, by including BMI and other adiposity indices as covariates in my analysis of an adult control and SS cohort, I showed that they had confounding effects on the associations with short stature; a set of six SNPs exclusively located in the promoter region of the GHR gene and a specific GT genotype were strongly associated with female SS (Chapter III). Using three different experimental approaches (luciferase reporter constructs carrying different lengths of the GT repeat, allele-specific expression assays of GHR and quantitative PCR of GH-IGF1 axis genes), I was able to show that the GT microsatellite acts, in a context- and sex-specific manner, as a cis regulator of GHR expression and potentially exerts trans effects on IGF1 and BCL2 (Chapter IV). These studies have shown the relevance of examining different types of genetic variants in the GHR gene for sex-specific associations with severe short stature and obesity and shed new light on the mechanisms regulating GHR expression.L'axe GH/IGF-1 joue un rôle important dans l'acquisition de la taille longitudinale mais aussi dans la régulation du métabolisme lipidique. La GH exerce ses effets par la liaison spécifique à son récepteur, le récepteur a l'hormone de croissance (GHR), sur les cellules cibles et par l'activation de multiples voies de signalisation, aboutissant à des changements au niveau de l'expression et de la fonction des gènes de la cellule. Par exemple, il est bien connu que la protéine GHR dysfonctionnelle entraîne le syndrome de Laron, caractérisé par une petite taille proportionnelle ainsi qu'une augmentation de l'adiposité abdominale.La petite taille idiopathique (ISS), un phénotype moins extrême, se retrouve dans 1-2% de la population humaine et est caractérisée par une taille moyenne >2DS au-dessous de la moyenne présentant néanmoins un profil endocrinien normal. L'étiologie de ce phénotype est encore inconnue; cependant, la présence d'un fort pourcentage d'individus présentant des taux sériques de GH légèrement élevés et d'IGF-1 légèrement bas suggèrent une diminution de sensibilité à l'hormone de croissance. De récentes études GWAS ont montré une association du gène GHR ainsi que d'autres membres de l'axe GH/IGF-1 avec la variation de taille dans la population caucasienne mais ces études n'incluent que rarement les extrêmes de la distribution staturale tel qu'observé dans ISS. La structure du gène GHR est caractérisée par une organisation unique du promoteur en 5'. Il comprend 13 différents premiers exons qui produisent des transcrits ubiquitaires ou présentant un profil d'expression spécifique au tissu ou encore au stade de développement; cependant, tous les ARNm codent pour la même protéine. De précédentes études dans notre laboratoire ont montré que des mécanismes fonctionnels mettant en jeu des facteurs de transcription régulent l'expression de plusieurs de ces transcrits. De plus, un microsatellite GT, situé dans le promoteur d'un transcrit majeur de GHR, a été montré comme étant polymorphique dans la population humaine mais sa fonction n'a pas été encore élucidée. Pour mon projet doctoral, j'ai émis l'hypothèse que différentes variations génétiques au sein du gène GHR- comprenant un ensemble de SNPs et un microsatellite GT- pourraient être associées aux phénotypes ISS et SS et que ces associations pourraient être influencées par des indices d'adiposité comme l'indice de masse corporelle (IMC). En utilisant des modèles de régression logistiques, j'ai trouvé des associations spécifiques et liées au sexe, de certains génotypes de la répétition GT ainsi que d'un SNP situé dans l'intron 2 avec les cohortes pédiatriques caucasiennes ISS (Chapitre II). De plus, en incluant l'IMC et d'autres indices d'adiposité comme covariables dans mon analyse d'une cohorte d'adultes contrôle et de petite taille, j'ai démontré que ces indices avaient des effets confondants sur les associations avec la petite taille; un ensemble de 6 SNPs situé exclusivement dans le promoteur du gène GHR ainsi qu'un génotype spécifique de la répétition GT ont montré une forte association chez la femme de petite taille (Chapitre III). En utilisant trois approches expérimentales différentes (vecteurs comprenant le gène rapporteur Luc ainsi que des longueurs variables de la répétition GT, tests d'expression allélique de GHR et analyse de l'expression des gènes de l'axe GH/IGF-1 par PCR quantitative), j'ai pu montrer que le microsatellite GT agit de façon spécifique selon le contexte et le sexe et constitue un régulateur en cis de l'expression de GHR tout en exerçant potentiellement des effets en trans sur les gènes IGF-1 et BCL-2 (Chapitre IV). Ces études ont montré l'importance d'examiner les différents types de variations génétiques dans le gène GHR et leurs associations avec la petite taille sévère et l'obésité et ouvrent de nouvelles perspectives sur les mécanismes régulant l'expression de GHR