Mecanismo de acción del factor represor Capicua, un sensor de señales Ras/MAPK

Tesis llevada a cabo para conseguir el grado de Doctor por la Universidad de Barcelona.--2017-07-21[ES] Las vías de señalización receptor tirosina quinasa (RTK) inducen múltiples respuestas biológicas, a menudo regulando la expresión de genes. La proteína HMG-box Capicua (Cic) es un represor transcripcional inactivado en respuesta a la señal RTK. Por su papel por debajo de las vías RTK, en humanos, el homólogo de Cic (CIC) está implicado en diferentes tipos de cáncer como oligodendroglioma y sarcomas de tipo Ewing-like. Tanto en Drosophila como en mamíferos, Cic se expresa como dos isoformas, Cic-L y Cic-S, cuya significancia y mecanismo de acción no se conocen del todo bien. Ambas isoformas contienen un dominio HMG-box presuntamente responsable de su unión al ADN en los enhancers de sus genes diana; y un motivo C-terminal llamado C1 con una función desconocida, pero indispensable para la función de Cic. Además, en Cic-S hay otro motivo conservado al que hemos llamado N2 con una función desconocida. Durante esta tesis, hemos tratado de caracterizar la función molecular de diferentes dominios de Cic esenciales para su función con el objetivo de entender mejor el mecanismo de acción de Cic. Hemos descubierto que la proteína Cic de Drosophila requiere del correpresor Gro en su función en el embrión temprano pero no durante otros estadios del desarrollo. El mecanismo dependiente de Gro requiere el motivo N2, único en la isoforma Cic-S, el cual es diferente a los motivos de interacción con Gro definidos hasta el momento. Nuestros datos indican que el motivo N2 apareció durante la aparición de los primeros dípteros, cuando la isoforma Cic-S evolucionó de la forma ancestral Cic-L. De acuerdo con esto, la isoforma Cic-L carece del motivo N2 y es completamente inactiva en el embrión de Drosophila, indicando que el motivo N2 aportó a Cic-S una nueva actividad dependiente de Gro en este tejido. Además, nuestros resultados implican que es improbable que las proteínas CIC de mamíferos actúen a través de Gro puesto que carecen del motivo N2, y han evolucionado independientemente de las formas Cic-S de dípteros. Por otro lado, hemos estudiado la sensibilidad de Cic a las vías Ras/MAPK en Drosophila. La proteína Cic de Drosophila contiene un motivo llamado C2 el cual es responsable de la interacción de Cic con MAPK. Hemos visto que este motivo, el cual sólo se había estudiado en el contexto de la forma Cic-S, es esencial para la regulación de ambas isoformas. Además, hemos encontrado que Cic puede estar regulado de formas adicionales a la vía Ras/MAPK. En el disco imaginal de ala, Cic puede ser fosforilado y regulado de manera aditiva por la vía Ras/MAPK y por Minibrain y su proteína adaptadora Wings apart. Por último, hemos caracterizado el modo de unión de Cic al ADN. Las proteínas HMG-box suelen unirse a ADN a través de este motivo, pero esta unión es relativamente débil y cada subfamilia HMG-box utiliza diferentes mecanismos para aumentar la afinidad y especificidad en su unión a ADN. Hemos visto que Cic emplea un nuevo mecanismo de unión a ADN que requiere del motivo distante C1. Ambos dominios son necesrios para la union a lugares octaméricos específicos en los enhancers de los genes diana de Cic, de modo que forman una estructura bipartita para una unión específica a ADN y este mecanismo opera tanto en Drosophila como en humanos. Finalmente el papel del motivo C1 en la unión a ADN explica el hecho de que este dominio esté frecuentemente mutado en oligodendroglioma, mientras que debe ser preservado cuando CIC actua como oncogén en las quimeras CIC-DUX4 que provocan sarcomas de tipo Ewing-Like.[EN] RTK signaling pathways induce multiple biological responses by regulating the expression of downstream genes. The HMG-box protein Capicua (Cic) is a transcriptional repressor downregulated in response to RTK signaling. In both Drosophila and mammals, Cic is expressed as two isoforms, Cic-S and Cic-L. Both isoforms contain two conserved domains: an HMG-box presumably responsible of binding to its target genes, and a C-terminal domain called C1 of unknown function. We discovered that Drosophila Cic relies on the Groucho (Gro) corepressor during its function in the embryo, but not during other stages of development. This Gro-dependent mechanism requires the N2 motif, a short peptide unique to Cic-S, different from other previously defined Gro-interacting motifs. The N2 motif is an evolutionary innovation that originated within dipteran insects, as the Cic-S isoform evolved from an ancestral Cic-L form. Our results suggest that the N2 motif endowed Cic-S with a novel Gro-dependent activity that is obligatory in the Drosophila embryo. We also investigated the regulation of Cic via phosphorylation, and we found that the C2 domain, the MAPK docking site of Cic, is important for both Cic-S and Cic-L isoforms. Moreover, we discover that in the imaginal wing disc, the phosphorylation by MAPK functions additively with the phosphorylation by Minibrain and Wings apart. On the other hand, we characterize the DNA binding mechanism of Cic. It is known that HMG-box proteins bind DNA via their HMG-box. This binding is relatively weak and HMG-box factors employ distinct mechanisms for enhancing their affinity and specificity for DNA. We report that the mode of Cic DNA binding distinguishes it from other HMG-box factors. We find that the HMG-box of Cic does not bind DNA alone but instead requires the C1 motif. Both domains are strictly necessary for binding specific octameric sites and we suggest that they form a bipartite structure for sequence-specific binding. This binding mechanism operates throughout Drosophila development and in human cells. Finally, the key role of C1 in DNA binding also explains the fact that this domain is a hotspot for inactivating mutations in oligodendroglioma, while being preserved in oncogenic CIC-DUX4 fusion chimeras associated to Ewing-like sarcomas.Peer reviewe