Producción heteróloga y caracterización bioquímica de una α-amilasa maltogénica de Lactobacillus plantarum WCFS1

Grado en Biología. Mención en Biotecnología.[ES]: Se ha caracterizado bioquímicamente una enzima α-amilasa maltogénica (α-MA) de Lactobacillus plantarum WCFS1 aislada de saliva humana. El gen codificante de la enzima de 574 aminoácidos fue clonado en el vector de expresión pURI3-Cter, el cual fue transformado en E. coli DH10B. La producción heteróloga de la enzima se realizó en E. coli BL21 (DE3), con un rendimiento de producción de 4.4mg de proteína por litro de medio de cultivo. La enzima recombinante mostró un óptimo de actividad a 30°C y a pH 6,0. El intervalo de pH en el cual presenta actividad está entre 4,0 y 7,0. El intervalo de temperatura en el que presenta actividad relativa mayor al 70%, se encuentra entre 22 y 37°C. La enzima fue termoestable al ser incubada durante 24 horas a temperaturas que van desde 22 a 30°C. En cambio, al ser incubada a 45 y 65°C, la enzima perdió su actividad a los 30 minutos y 4 horas, respectivamente. La enzima recombinante presenta una alta tolerancia a los aditivos: Triton-x-100, Tween-20, Mg2+ y β-mercaptoetanol mientras que los aditivos Fe2+, K+ y DMSO incrementaron su actividad relativa. Los aditivos: Ca2+, Hg2+, Zn 2+, Cu2+, Ni2+, Mn2+ y Tween-80, inhibieron parcial o completamente la actividad enzimática relativa. Los parámetros cinéticos calculados mediante la hidrólisis de 4-nitrofenil-α-D-maltopentaósido (pNP-G5) dieron como resultado: KM= 3,0159±0,2964mM; Vmax=1,6715±0,0739 min-1;Kcat= 1008,227±44,58 min-1.[EN]: A maltogenic α-amylase (α-MA) from Lactobacillus plantarum WCFS1 isolated from human saliva was characterized. A maltogenic amylase gene encoding 574 amino acids protein was cloned in pURI3-Cter expression vector and transformed in E. coli DH10B. Recombinant expression was made in E. coli BL21(DE3) cells. The concentration of purified protein was 4.4 mg of protein per liter of growth culture. The results showed that the recombinant enzyme had an activity optimum at 30°C and pH 6.0. It was stable at pHs ranging from 4,0 to 7,0. The range of temperatures in which the enzyme had over 70% of relative activity was between 22 and 30°C. The enzyme was stable when incubated for 24 hours at temperatures ranging from 22 to 30°C. In contrast, the enzyme was inactive by incubation at 45 and 65°C, for 30 minutes and 4 hours respectively. The catalytic activity of the enzyme was increased when Fe2+, K+ and DMSO were added. However, it can be partially or completely inhibited by Ca2+, Hg2+, Zn2+, Cu2+, Ni2+, Mn2+, Tween-80. Its catalytic function was stable in the presence of Triton-x-100, Tween-20, Mg2+ y β-mercaptoethanol. The enzyme kinetics were studied by using 4-nitrophenyl-α-D-maltopentaoside (pNP-G5) and presented the following kinetics parameters: KM= 3,0159±0,2964 mM; Vmax=1,6715±0,0739 min-1; Kcat= 1008,227±44,58 min-1.Peer Reviewe