Alvéole-sur-puce: Modèle dynamique au contact de la barrière alvéolo-capillaire : micro-fabrication, microfluidique et cellules souches pluripotentes induites.

Pollutions particles are responsible for millions of premature death. Nanoparticles (with a diameter below 100 nm) reach the alveolar sacs where they encounter the alveolar capillary barrier. This barrier is constituted of an alveolar epithelium and an endothelium back to back on an ultra-thin membrane (about 0.2 µm), submitted to constant stimuli due to cyclic alveolar inflation and blood flow shear stress. We focused here on developing an innovative in vitro model of the alveolar capillary barrier to study the interactions of the nanoparticles with this barrier. Firstly, we have developed a micro-engineered substrate reproducing the geometrical and physical properties of the alveolar capillary membrane. We implemented the co-culture of an alveolar epithelium (A549) and an endothelium (HUVEC) on this membrane. We used confocal microscopy to observe the behavior of our model regarding barrier integrity and specific phenotypes. Finally, we observed the interactions between Silica nanoparticles and our model in terms of toxicity, internalization and translocation.Secondly, we developed a two-chamber microfluidic chip reproducing the specific microenvironment of the alveoli around our co-culture model. Studies of mechanical design and fabrication processes optimization allowed for the generation of a reversible chip compatible with long-term culture and live observation with a confocal microscope.Thirdly, we launched preliminary experiments aiming at the integration of differentiated induced pluripotent stem cells in our in vitro model. We worked on optimizing two directed differentiation protocols: towards an endothelium and towards an alveolar epithelium.Finally, we present here an in vitro model with numerous features: a close-contact co-culture on an ultra-thin membrane enabling important intercellular communication, a long-term culture allowing for live monitoring, mimicking the in vivo dynamic stimuli of the alveolar capillary barrier microenvironment and the possibility for nanoparticles interaction and translocation studies.Les particules issues de la pollution sont responsables de millions de morts prématurées. Les nanoparticules (au diamètre inférieur à 100 nm) atteignent les alvéoles où elles rencontrent la barrière alvéolo-capillaire. Cette barrière est composée d'un épithélium alvéolaire et d'un endothélium, dos à dos contre une membrane ultrafine (environ 0.2 µM), soumis à une stimulation constante exercée par l'inflation cyclique des alvéoles et par le cisaillement dû à la circulation sanguine. Nous nous sommes appliqués à développer un modèle in vitro innovant de cette barrière alvéolo-capillaire afin d'observer les interactions des nanoparticules avec cette barrière.Dans un premier temps, nous avons développé un substrat micro-fabriqué qui reproduit les propriétés géométriques et physiques de la membrane alvéolo-capillaire. Sur cette membrane, nous avons mis en place une co-culture de cellules épithéliales alvéolaires (A549) et endothéliales (HUVEC). Grâce à une étude de microscopie confocale, nous avons observé le comportement de ce modèle en termes d'étanchéité et de fonctions biologiques. Finalement nous avons observé les interactions entre des nanoparticules de silice et notre modèle en termes de toxicité, d'internalisation et de translocation.Dans une seconde partie, nous avons développé une puce microfluidique à deux chambres qui permet de reproduire autour de notre modèle de co-culture le microenvironnement spécifique des alvéoles pulmonaires. Des études de conception mécanique et l'optimisation de méthodes de microfabrication nous ont permis de générer une puce réversible compatible avec de la culture à long-terme et de l'observation en live par microscopie confocale. Dans une troisième partie, nous avons commencé un travail préliminaire visant à intégrer des cellules pluripotentes induites différenciées dans notre modèle in vitro. Nous avons travaillé à optimiser deux protocoles de différentiation sur une lignée commerciale: vers un endothélium et vers un épithélium alvéolaire. Finalement, nous proposons ici un modèle in vitro offrant de nombreux avantages: une importante communication intercellulaire via leur co-culture sur une membrane ultrafine, une culture long-terme observable au quotidien, la reproduction des stimuli dynamiques de l'environnement alvéolo-capillaire in vivo et la possibilité d'effectuer des tests d'interaction et de translocation de nanoparticules