Enzymatic synthesis of biodiesel from high free fatty acid feedstock using a recombinant Rhizopus oryzae lipase

La tesi que es presenta a continuació està encarada, en termes generals, en la utilització d'una lipasa recombinant de Rhizopus oryzae (rROL) expressada en un llevat metilotròfic (Picchia pastoris) i immobilitzada en un suport de polimetacrilat, per a la síntesi enzimàtica de biodièsel. La característica més important d'aquest enzim és la seva regió-especificitat, que permet catalitzar l'alcohòlisi dels enllaços èsters sn-1 i sn-3 del triglicèrid en dos alquil-èsters d'àcid gras (biodièsel). La utilització de la rROL esdevé un punt clau per al procés ja que no es forma glicerol, sinó 2-monoglicèrid, un producte de valor afegit. La primera part de la tesi està enfocada en l'avaluació d'una nova matèria primera com a substrat per a la producció de biodièsel. L'oli d'orujo (o de pinyolada) és un oli vegetal que pot ser representatiu d'olis amb alt contingut en àcids grassos lliures, com la majoria d'olis de rebuig. Així doncs, es realitzen estudis preliminars per conèixer el rol d'aquests àcids grassos en termes de velocitat inicial de reacció i estabilitat de la rROL. D'altra banda, es procedeix a la immobilització de l'enzim per enllaç covalent per tal d'assegurar-ne l'estabilitat i reutilització. Després, l'èmfasi es posa sobretot en la millora de la reacció en vials de 10 mL. Per tal de millorar la velocitat inicial de reacció i l'estabilitat de l'enzim, es realitzen proves a diferents temperatures i activitat inicial d'aigua. També es compara la forma d'addicionar els dos acceptors d'acil més utilitzats actualment, el metanol i l'etanol, en reaccions d'un, cinc i deu polsos. Després, es compara l'estabilitat i es calculen les productivitats per tal de trobar el més adequat. Seguidament es duu a terme el canvi d'escala del procés a través d'un reactor de 50 mL reproduint els experiments anteriors. Estudis posteriors permeten calcular la vida mitja de l'enzim en les diferents reaccions, com també les productivitats. Finalment, s'addiciona de forma semi-continua, per mitjà d'una micro-bureta automatitzada, l'acceptor d'acil amb el que s'obtenen els millors resultats. L'últim capítol es basa en la simulació d'un procés industrial per a la síntesi enzimàtica de biodièsel amb els resultats prèviament obtinguts. Es planteja un procés per a la producció i la purificació tant del biodièsel com del subproducte, 2-monoglicèrid i s'utilitza un software específic (SuperPro Designer®) per al desenvolupament del projecte. Se n'estudia la viabilitat i els canvis suggerits per aconseguir la seva rendibilitat.The present thesis is focused, in general terms, on the enzymatic synthesis of biodiesel using a recombinant Rhizopus oryzae lipase (rROL), expressed in a methylotrophic yeast (Pichia pastoris) as a cell factory and immobilised onto a polymethacrylate support. The main feature of this enzyme is its regioespecificity, which allows to catalyse the alcoholysis of sn-1 and sn-3 ester bonds of the triglyceride into two fatty acid alkyl esters (biodiesel). The use of rROL becomes a key factor since glycerol is not formed as a by-product in favour of 2-monoglyceride. The first part of the thesis is focused on the evaluation of a novel feedstock as a substrate for biodiesel production. Alperujo oil is a vegetable oil, which can be representative of other high-FFA feedstocks, considered waste-oils. Preliminary studies are performed to find out the role of this FFA in terms of initial reaction rate and stability of the rROL. Moreover, the enzyme has been immobilised by covalent binding to ensure its stability and recovery. During the following parts, emphasis is put on the improvement of the enzymatic reaction itself using 10-mL vials. Temperature and initial water activity are set up in order to increase initial rate and enzyme stability. In addition, the two most used acyl-acceptors are compared. Methanol and ethanol are added using three stepwise strategies: one, five and ten pulses. Stability and productivity are also compared in order to find out the best one. Then, scale up to a 50-mL stirred-reactor is carried out by reproducing the previous experiments. Initial rates and stability are compared. Further analysis allowed to calculate enzyme's half-life times and productivities in the different reactions. Semi-continuous addition of the acyl-acceptor which best results were obtained with, is attempted by using an automatised micro-burette. Last chapter is focused on the simulation of an industrial process of enzymatic production of biodiesel using all the previous obtained results. Specific software (SuperPro Designer®) is used to raise and develop a process to produce and purify the biodiesel as well as its by-product (2-monoglyceride). Then, viability studies are performed and some modifications are suggested in order to find out a profitable and feasible process