In-cell recordings with 3D microelectrode arrays

Micro Electrode Arrays (MEAs) have been used for 40 years to record extracellular signal from electrically excitable cells. The development of three dimensional microstructured electrodes has been shown to improve the electrical contact between cell and electrode. This can allow to reduce the electrode dimensions to improve spatial resolution, to have a one-toone correspondence between cell and electrode and, applying an electrical stimulus, to obtain in-cell like recordings. In-cell like recordings resemble in their time course the transmembrane voltage obtained by an intracellular sharp electrode during electrical activity. Appropriate electrical stimulation transiently increases the leakage membrane conductance and gives access to a signal substantially different from the extracellular one. The aim of this thesis is to develop different electrodes designs and to investigate on cardiomyocytes cell cultures the feasability of in-cell recordings. Standard MEAs (tip-shaped and planar electrodes) were compared with self-developed MEAs. The duration of the in-cell signal, his amplitude, the voltage threshold to induce it and his repeatability over minutes and hours were studied by varying the stimulus duration and the stimulus voltage. We successfully processed solid and hollow pillars electrodes as well as mushroom-shaped electrodes. On these electrodes we recorded extracellular action potential from cardiomyocytes. The stimulation protocols successfully evoked in-cell like signals on all the electrodes. In-cell recordings could be obtained onto the same cell over several hours and occasionally days. Hollow pillars induced longer in-cell recording, tip-shaped electrode had a lower threshold. However the large variability of in-cell like recordings on the different electrode shapes does not suggest one particular shape to be used in future. A promising spontaneous in-cell recording was obtained in one culture, opening to future development on three-dimensional microelectrodes research. I Micro Electrode Array (matrici di micro elettrodi) sono stati usati negli ultimi 40 anni per registrare segnale extracellulare da cellule eccitabili come i neuroni. Lo sviluppo di elettrodi tridimensionali microstrutturati ha permesso di aumentare il contatto elettrico tra cellula ed elettrodo. Questo può essere sfruttato per aumentare la risoluzione spaziale, avere una corrispondenza unoa- uno tra cellula ed elettrodo e, applicando uno stimolo elettrico, per ottenere un segnale similintracellulare detto "in-cell". Questo tipo di segnale assomiglia al potenziale di membrana misurato da un elettrodo appuntito intracellulare durante un potenziale d'azione. La stimolazione elettrica infatti, aumentando transitoriamente la conducibilità della membrana da accesso ad un segnale sostanzialmente differente da quello extracellulare. Lo scopo di questa tesi è di sviluppare diverse forme e design di elettrodo e di investigare su colture cellulari di cardiomiociti la fattibilità di registrazioni "in-cell". Oltre agli elettrodi autoprodotti, sono stati confrontati elettrodi "a punta" e planari, disponibili in commercio. Gli elettrodi sono stati confrontati cambiando la durata e la tensione dello stimolo elettrico, per valutare le variazioni nella durata del segnale "in-cell", la sua ampiezza, la soglia di tensione che lo induce, e la ripetibilità per minuti ed ore. Abbiamo creato con successo elettrodi con la forma di cilindri pieni e vuoti e "a fungo", registrato potenziali d'azione extracellulari da cardiomiociti con essi, e ottenuto la registrazione di segnali "in-cell" con l'applicazione di protocolli di stimolazione elettrica. È stato possibile ripetere questi protocolli sulle stesse cellule per diverse ore e a volte giorni. I cilindri vuoti hanno indotto le registrazioni "in-cell" più lunghe, elettrodi a punta hanno mostrato una soglia di tensione inferiore. Ciononostante, la grande variabilità di questi risultati non suggerisce nessun tipo di forma preferenziale da usare in futuro. Un promettente segnale “in-cell” spontaneo (senza bisogno di stimolazione elettrica) è stato ottenuto in un caso, aprendo a futuri sviluppi nella ricerca sui microelettrodi tridimensionali