Développement de méthodes de spectrométrie de masse pour l'étude de la dynamique des complexes de protéasome : application aux cellules stromales/souches mésenchymateuses humaines

Les protéines sont des biomolécules majeures dans l'ensemble des processus cellulaires. La régulation fine de leur concentration est donc essentielle dans la survie et le développement d'une cellule et peut avoir lieu en amont ou en aval de leur synthèse. Un des systèmes cellulaires capable de dégrader les protéines est le système Ubiquitine-Protéasome. Le protéasome 26S, élément central de ce système, est composé d'un cœur catalytique, le protéasome 20S et d'une particule activatrice, le régulateur 19S. Le protéasome 20S est un complexe multiprotéique présentant une très grande diversité structurale de par l'incorporation d'isoformes de certaines sous-unités. De plus, le protéasome 20S peut être retrouvé sous forme libre ou associé avec un ou deux régulateurs 19S dont la fonction est d'augmenter l'activité protéolytique mais aussi de recruter des substrats à dégrader via la reconnaissance de leur chaîne d'ubiquitine. D'autres activateurs du protéasome 20S ont été décrits, PA28aß, PA28ƴ et PA200, mais fonctionnent de manière ubiquitine-indépendante et leurs rôles cellulaires et leurs substrats sont moins étudiés que ceux du régulateur 19S. Le but de ce travail de thèse a été de développer des méthodes originales de spectrométrie de masse permettant une meilleure compréhension du fonctionnement de ces complexes et d'appliquer ces méthodes aux cellules souches/stromales mésenchymateuses du tissu adipeux humain (ADSC), actuellement très étudiées pour leurs potentiels thérapeutiques. Lors d'une première partie, nous avons développé une méthode de spectrométrie de masse ciblée permettant de déterminer de façon sensible et précise la quantité absolue de protéasome 20S total ainsi que la stœchiométrie des différentes formes de protéasome 20S actuellement décrits. Cette méthode a été appliquée à des cellules en culture, à des tissus humains, mais également à des cellules primaires de type ADSC. Cette nouvelle technologie nous a permis de montrer une modulation de la quantité de protéasome 20S en fonction des conditions de culture utilisées. Ces résultats suggèrent que le protéasome 20S pourrait être un indicateur à suivre lors de la production de ces cellules à des fins cliniques. Dans une deuxième partie de cette thèse, nous sommes intéressés à la caractérisation de FAM192A, une protéine de fonction jusqu'alors inconnue que nous avons identifiée dans l'interactome du protéasome 20S nucléaire, et plus particulièrement comme interagissant avec le régulateur PA28ƴ. Nos résultats ont montré que FAM192A est phosphorylée, module la localisation subcellulaire de PA28ƴ et son rôle dans les corps nucléaires de Cajal, et augmente la capacité d'association de PA28ƴ avec le protéasome 20S. Enfin, dans une dernière partie, nous avons mis au point une méthode basée sur une analyse par spectrométrie de masse quantitative multiplexée permettant l'identification de substrats dégradés par le protéasome 20S associé au régulateur PA28ƴ. Cette approche permet d'identifier des substrats sans apriori en une unique analyse, ce qui la distingue des études déjà publiées.Proteins are the main biomolecules controlling cellular biological processes. The precise control of their concentration is essential for the survival and development of cells. This regulation can be done upstream of their synthesis (modulation of gene expression), or through degradation by specific cellular pathways such as the Ubiquitin-Proteasome System. The 26S proteasome, which plays a central role in this pathway, is composed of a catalytic core, the 20S proteasome, and an associated regulator, the 19S regulator. The 20S proteasome is a multi-protein complex presenting a high structural diversity resulting from the combination of specific subunits in proportions that vary in different cell types. Other regulators are described as modulator of proteasomal activity, such as PA28aß, PA28ƴ and PA200, but their substrate recognition is ubiquitin-independent and their mechanism are less described compared to the 19S regulator. The aim of this thesis was to develop original mass spectrometry methods to characterize the proteasome subunit associations and apply these methods to the study of human adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells (ADSC), currently appreciated and studied for their therapeutic potentials. In the first part of this thesis, we developed a mass spectrometry-based strategy to determine absolute quantity of total 20S proteasome and the different described 20S proteasome forms stoichiometry. With this approach, we were able to detect all the different forms of the 20S proteasome described to date. This method was then applied to several human tissues and to ADSC. This method permitted us to measure the quantity and proportion variation of the different 20S proteasome forms depending on the cell culture conditions. This results suggest that 20S proteasome could be a potential marker to measure during cell production for clinical purposes. In a second part, we focused on FAM192A, a functionally undescribed protein identified in nuclear 20S proteasome interactome and more specifically with the PA28ƴ. Our results showed that FAM192A is phosphorylated, modulates PA28ƴ subcellular localization and its role in Cajal bodies but also increase its capacity to interact with the 20S proteasome. Finally, in the last part, we developed a method to identify the proteasome substrates that are degraded by 20S proteasome associated with the PA28ƴ regulator. In contrast to classical approaches used to identify proteasome substrates, this multiplexed mass spectrometry analysis allowed us to determine which proteins are degraded in a regulator-dependent fashion without a priori