Caracterização molecular e avaliação da atividade antimicrobiana de novos fatores anti-lipopolissacarídeos (ALFs) de camarões peneídeos

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2018.Os Fatores Anti-lipopolissacarídeos (ALFs) compõem uma família diversa de peptídeos antimicrobianos (AMPs) que apresentam uma região entre cisteínas (estrutura ß-hairpin) capaz de se ligar a componentes da superfície microbiana. A fim de investigar a implicação biológica da diversidade molecular encontrada nessa família de AMPs, novas sequências de ALFs foram identificadas em camarões peneídeos e caracterizadas em nível molecular, transcricional e funcional. As análises in silico realizadas com sequências provenientes de bancos de dados públicos mostraram que a diversidade de ALFs é maior do que o descrito até o momento, sendo encontrados pelo menos sete genes distintos de ALFs em camarões peneídeos (Grupos A a G). Neste trabalho, utilizando a espécie mais cultivada de camarão peneídeo (Litopenaeus vannamei), avaliou-se o perfil transcricional de ALFs em diferentes tecidos, frente infecções experimentais com dois patógenos não relacionados (a bactéria Gram-negativa Vibrio harveyi e o vírus da Síndrome da Mancha Branca) e ao longo do desenvolvimento do camarão. Os ALFs de L. vannamei (Litvan ALF-A a -G) mostraram-se expressos em hemócitos e regulados diferencialmente em resposta às infecções experimentais. Além disso, alguns ALFs se mostraram presentes nos estágios larvais iniciais, sugerindo a participação desses AMPs no desenvolvimento do camarão. A atividade antimicrobiana de peptídeos sintéticos derivados da região entre cisteínas (ß-hairpin) dos novos ALFs identificados em L. vannamei (Litvan ALF-E a -G) foi avaliada contra diferentes microrganismos. Curiosamente, enquanto os peptídeos derivados de Litvan ALF-E e Litvan ALF-G se mostraram ativos contra bactérias Gram-positivas, peptídeos derivados de Litvan ALF-F se mostraram inativos contra os microrganismos testados. Em conjunto, esses resultados demonstram que os ALFs compõem uma família altamente diversa de AMPs de camarões peneídeos, em nível de sequência, expressão gênica e função.Abstract : Anti-lipopolysaccharide factors (ALFs) comprise a diverse family antimicrobial peptides (AMPs) holding a central ß-hairpin structure able to bind to microbial cell wall components. In order to explore the biological significance of the molecular diversity found in the ALF family, we have identified and characterized novel ALF members in penaeid shrimp and evaluated them at molecular, transcriptional and functional levels. In silico mining of publicly accessible databases revealed that the diversity of ALFs are not restricted to five members, but at least seven distinct ALF genes are found in penaeid shrimp (ALF Groups A to G). By using the most cultivated shrimp species (Litopenaeus vannamei) as a model organism, the transcriptional profile of shrimp ALFs were compared in terms of tissue distribution, gene expression response to two unrelated pathogens (the Gram-negative Vibrio harveyi and the White spot syndrome virus) and during shrimp development. L. vannamei ALFs (Litvan ALF-A to -G) showed to be expressed in hemocytes and differentially regulated in response to challenge. Besides, some ALF members were found to be transcribed in the first larval stages, suggesting the participation of these AMPs in shrimp development. Synthetic peptides based on the central ß-hairpin of the novel ALFs identified in L. vannamei (Litvan ALF-E to -G) were tested against different microorganisms. Interestingly, while Litvan ALF-E and Litvan ALF-G ß-hairpins showed to be active against Gram-positive bacteria, no activity was recorded for the synthetic ß-hairpin of Litvan ALF-F. Altogether, our results showed that ALFs form a highly diverse family of shrimp AMPs, from sequence to expression regulation and function