Investigação do mecanismo de morte celular induzido por tiossemicarbazonas em linhagens de céluLas de leucemias agudas humanas

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2018.Câncer compreende um conjunto de mais de 100 doenças que têm em comum o crescimento desordenado de células que invadem tecidos e órgãos. De acordo com o tecido atingido pode ser dividido em dois grupos: tumores sólidos (carcinomas e sarcomas) e neoplasias do tecido hematopoiético e linfoide onde se encontram as leucemias. As leucemias constituem um grupo heterogêneo de neoplasias malignas caracterizadas pela proliferação desordenada de um clone de células hematopoiéticas anormais, com alterações na diferenciação, na maturação e na regulação da hematopoiese. A quimioterapia é o tratamento mais utilizado para leucemias, porém apresenta efeitos adversos severos, altas taxas de recidiva e resistência ao tratamento. Nesse contexto, um número crescente de trabalhos vem buscando substâncias biologicamente ativas de origem natural ou sintética que possam ser utilizadas como o princípio ativo de antineoplásicos com maior especificidade na indução de apoptose. Nessa linha as tiossemicarbazonas vem sendo descritas na literatura como promissores compostos antitumorais, pois sua síntese é versátil, de baixo custo e de alta quimiosseletividade, além disso já tem relatos de serem citotóxicas para outras células tumorais. Com esta perspectiva este estudo teve como objetivo a busca por novos compostos a partir de 33 tiossemicarbazonas sintéticas que apresentem atividades contra células leucêmicas, e avaliar o mecanismo de morte celular do composto mais ativo in vitro. Entre os compostos avaliados a tiossemicarbazona LAP17(E)-2-(4-metilbenzilideno)-N-(naftaleno-1-yl) hidrazinecarbotiamida apresentou resultados mais promissores e foi selecionada para estudos posteriores. Para os ensaios de citotoxicidade as células K562 e Jurkat foram incubadas com LAP17 em concentrações crescentes por 24, 48 e 72 horas. A viabilidade celular foi determinada pelo método do MTT onde foi observado que o composto reduziu a viabilidade celular das duas linhagens testadas de uma maneira dependente da concentração e do tempo de incubação. Para avaliar se LAP17 é seletivo para células leucêmicas foi analisado seu efeito sobre células mononucleadas de indivíduos saudáveis e com a finalidade de verificar se o composto possui atividade hemolítica foi realizado o teste de hemólise. LAP17 não reduziu significativamente a viabilidade das células normais e também não apresentou atividade hemolítica significativa. A apoptose foi confirmada pela observação morfológica após coloração com brometo de etídio e laranja de acridina, pelo ensaio de fragmentação do DNA e por citometria de fluxo pelo método da Anexina-V. A investigação do efeito no ciclo celular analisada por citometria de fluxo mostrou que LAP17 causa um bloqueio na fase G2/M do ciclo nas células K562 e Jurkat. A fim de investigar os mecanismos pelos quais o composto causou morte celular foi avaliado o efeito do composto no potencial mitocondrial e na expressão das proteínas Bcl-2, Bax, FasR, AIF e caspase-3 por citometria de fluxo nas células K562 e Jurkat. Os resultados demonstraram que LAP17 não causou alteração no potencial mitocondrial de nenhuma das linhagens testadas. O composto não causou alterações na proteína Bcl-2 nas células K562 e Jurkat e um aumento expressivo das proteínas Bax tanto na célula K562 quanto na célula Jurkat demonstrando assim o predomínio de Bax e sugerindo o envolvimento da ativação da via intrínseca da apoptose. Também foi observado um aumento de FasR indicando assim o envolvimento da via extrínseca. Além disso o mecanismo de ação de LAP17 envolveu o aumento da expressão da caspase-3 e do fator indutor de apoptose. Assim o conjunto de resultados sugere que LAP17 é um protótipo promissor para o estudo e desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento de neoplasias hematológicas.Abstract : Cancer consist of a group of more than 100 diseases that have in common the uncontrolled growth of cells that invade tissues and organs. It can be classified according to the affected tissue into two groups: solid tumors (carcinomas and sarcomas) and neoplasms of hematopoietic and lymphoid tissue. The leukemias are a heterogeneous group of hematologic malignant neoplasms characterized by the irregular proliferation of an abnormal hematopoietic cells clone, promoting changes in the differentiation, maturation and regulation of hematopoiesis. Chemotherapy is the most commonly used treatment for leukemia, but it has severe adverse effects, high rates of relapse and resistance to treatment. In this context, an increasing number of studies have been seeking for natural or synthetic biologically active substances that may be used as active principle of antineoplastic agents with greater specificity in the induction of apoptosis. Thiosemicarbazones have been described in the literature as promising antitumor compounds because of their versatile synthesis, low cost and high chemo-selectivity, and also for having been reported to be cytotoxic to other tumor cells. Thus, this study aimed to find new compounds that exhibit activity against leukemic cells among 33 synthetic thiosemicarbazones, and to evaluate the mechanism of cell death of the most active compound in vitro. The thiosemicarbazone LAP17 (E)-2-(4-methylbenzylidene)-N-(naphthalen-1-yl) hydrazinecarbothioamide was found to be the most promising compound therefore it was selected for further studies. The K562 and Jurkat cells were incubated with increasing doses of LAP17 for 24, 48 and 72 hours for the cytotoxicity assays. Cell viability was determined by the MTT method where it was observed that the compound decreases cell viability in both cell lines in a concentration- and time-dependent manner. To evaluate if LAP17 is selective for leukemic cells its effect on mononuclear cells of healthy individuals was analyzed and in order to assess if the compound has hemolytic activity the hemolysis test was performed. LAP17 did not significantly reduce the viability of normal cells and also did not show significant hemolytic activity. Apoptosis was confirmed by morphological observation after staining the cells with acridine orange/ethidium bromide followed by DNA fragmentation assay and with Annexin V followed by flow cytometry analysis. The investigation of the effect on cell cycle analyzed by flow cytometry showed that LAP17 causes a block in the G2/M phase of the cycle in both cell lines, K562 and Jurkat. The effect of LAP17 on mitochondrial potential and on the expression of Bcl-2, Bax, FasR, AIF and caspase-3 proteins was analyzed by flow cytometry in K562 and Jurkat cells to investigate the mechanisms by which the compound caused cell death. The results demonstrated that LAP17 did not cause alteration in the mitochondrial potential in any of the tested cell lines, K562 and Jurkat. The compound didn´t cause any changes of Bcl-2 protein and to an expressive increase of Bax proteins in both cell lines, demonstrating predominance of Bax and suggesting the involvement of the activation of the intrinsic apoptotic pathway. It was also observed an increase in the expression of the protein FasR indicating the involvement of the extrinsic pathway as well. Moreover, the mechanism of action of LAP17 involves increased expression of caspase-3 and the apoptosis-inducing factor. Taken together, the results suggests that LAP17 is a promising prototype for the study and development of new drugs for the treatment of hematological malignancies