Functional and structural studies of lipase from Candida antarctica (CalB) treated in pressurized fluids

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro Tecnológico, Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos, Florianópolis, 2018.Lipase B de Candida antartica (CalB) é um dos biocatalizadores mais utilizados em síntese orgânica devido à sua capacidade de atuar em diversos substratos, apresentar ampla especificidade pelo substrato e enantiosseletividade, tolerância a meios não aquosos e resistência à desativação térmica. CalB foi caracterizada, tratada em fluidos pressurizados e sua estrutura determinada por cristalografia de raios X antes e após o tratamento em alta pressão. Dicroísmo circular, fluorimetria diferencial de varredura, espectrometria de massas e cromatografia por exclusão de tamanho espalhamento de luz a múltiplos ângulos foram algumas das técnicas utilizadas para caracterizar a CalB. A lipase é composta por 50,9% de a-hélices e folhas-ß paralelas e antiparalelas, e apresentou uma temperatura de fusão máxima de 65,1 ºC em TrisHCl 50 mM pH 8,4. Cristais da CalB purificada por filtração em gel, não tratada em alta pressão, difrataram a 1,7 Å e, resolvendo a estrutura por substituição molecular, foi verificado que a a5 não está presente na nossa molécula, provavelmente devido à presença de um ligante no sítio ativo (Ser105). Também foi possível modelar na estrutura da CalB duas moléculas de N-acetilglucosamina (NAG) ligadas a Asn74, seguidas por três moléculas de manose. Esta é a primeira estrutura da CalB que mostra um estado intermediário enzima/substrato ligado determinada até o momento. Uma atividade de hidrólise residual específica de 132% foi observada quando a CalB foi exposta em dióxido de carbono (CO2) a 35 ºC, 75 bar por 1 hora. A atividade de hidrólise da CalB foi de 142% quando tratada com gás liquefeito de petróleo (GLP) a 65 ºC, 30 bar e 1 hora, e os cristais da CalB purificada após exposição a essas condições difrataram a 2,15 Å. Cristais da CalB purificada após exposição a 160 bar, 35 ºC e 1 hora em CO2 (atividade residual de 89%) difrataram a 2,3 Å. Não foi possível modelar um substrato ligado a Ser105 na CalB tratada com CO2 e a densidade eletrônica foi suficiente apenas para alocar duas moléculas de NAG ligadas a Asn74. Por outro lado, foi possível modelar um ligante na Ser105 em três das seis moléculas da unidade assimétrica da CalB tratada com GLP e apenas uma molécula de NAG foi modelada anexada a Asn74. Os tratamentos com CO2 ou GLP efetivamente mudam a conformação da proteína, ao ponto que a CalB é mais propensa a perder seu ligante e seus açúcares, seja concomitantemente com o tratamento ou durante a etapa de filtração em gel, promovendo, portanto, outras possibilidades de empacotamento do cristal. Considerando a falta de estudos sobre modificações estruturais de enzimas causadas pelo tratamento sob alta pressão, os resultados atuais são inéditos na literatura especializada e podem ajudar a entender os fenômenos de ativação e desativação da CalB em CO2 e GLP, bem como estimular a aplicação de tais técnicas a outras enzimas de interesse.Abstract : CalB from Candida antarctica is one of the biocatalysts most used in organic synthesis due to its ability to act in several substrates, wide substrate specificity and enantioselectivity, tolerance to non-aqueous environment and resistance to thermal deactivation. CalB was characterized, treated in pressurized fluids and its structure was determined by X-ray crystallography before and after high-pressure treatment. Circular dichroism, differential scanning fluorimetry, mass spectrometry and size exclusion chromatography multi-angle light scattering were some of the techniques used to characterize CalB. The lipase is composed of 50.9% of a-helix and parallel and antiparallel ß-sheets, and showed a maximum melting temperature of 65.1 ºC in 50 mM TrisHCl pH 8.4. Crystals of untreated gel-filtration purified CalB diffracted to 1.7 Å and, by solving the structure by molecular replacement it was noticed that a5 is not present in our molecule, probably due to the presence of a ligand at the active site (Ser105). It was also possible to model in the CalB structure two N-acetylglucosamine (NAG) molecules attached to Asn74, followed by three mannoses. This is the first CalB structure showing an intermediate bound-state enzyme up to date. Residual specific hydrolysis activity of 132% was observed when CalB was exposed to carbon dioxide (CO2) at 35 ºC, 75 bar and 1 hour. CalB hydrolysis activity was 142% when treated with liquefied petroleum gas (LPG) at 65 ºC, 30 bar and 1 hour, and crystals of CalB purified after exposure to these conditions diffracted to 2.15 Å. Crystals of CalB purified after exposure to 160 bar, 35 ºC and 1 hour in CO2 (residual activity of 89%) diffracted to 2.3 Å. It was not possible to place a substrate bound to Ser105 in the CO2 treated CalB and the electronic density was only enough to place two NAG molecules attached to Asn74. On the other hand, it was possible to place a ligand bound to Ser105 in three of the six molecules of the asymmetric unit of CalB treated with LPG and only one NAG molecule was modeled attached to Asn74. The treatments under CO2 or LPG do change the protein conformation to the point that CalB is more prone to lose its ligand and its sugars, either concomitantly with the treatment or during the gel-filtration run, therefore promoting other crystal packing possibilities. Considering the lack of studies concerning structural modifications of enzymes caused by treatment under high pressure, the present results are unprecedented in the specialized literature, and may help to understand CalB activation and deactivation phenomena in SC-CO2 and LPG as well as to encourage the application of such techniques to other enzymes of interest