Iminoboronates as useful scaffolds for tumor-targeting

Tese de doutoramento, Farmácia (Química Farmacêutica e Terapêutica), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2018Boron has an unique set of chemical and physical properties, since it lies on the borderline between non-metals and metals and is also next to carbon in the periodic table. Boronic acids are trivalent boron compounds with a strong Lewis acid character, therefore they are able to chelate with Lewis base donors through dynamic covalent bonds. These bonds are the ideal tools to construct reversible multicomponent systems, since these ligations can be stable as covalent bonds or reversible as non-covalent bonds, depending on the stimulus applied. Carcinogenesis is classified as a multifaceted biological process and recent therapies are focus in interrupting one or more of these stages by the use of selective multivalent conjugates. Herein, a novel modular platform for the construction of cancer-cell-targeting drug conjugates is described and is based on multifunctional and reversible boronate complexes (B-complexes), which were designed to accommodate bortezomib (Btz), polyethylene glycol (PEG) chains and folate targeting units. These B-complexes revealed to be stable under biocompatible conditions (e.g. t1/2 (72) in human plasma = 60 h), and were hydrolyzed in the presence of glutathione (GSH), leading to intracellular cargo delivery in cancer cells. Small-molecule drug conjugates (SMDCs) 63 and 67 demonstrated a high selectivity for folate-positive MDA-MB-231 cancer cell line and IC50 values in the low nanomolar range. This modular technology was also employed in the construction of responsive and electronically tunable fluorescent boronic acid salicylidenehydrazone (BASHY) complexes, which revealed to have suitable structural and photophysical properties for live cell bioimaging applications. This modular approach enabled the straightforward synthesis (yields up to 99 %) of structurally diverse and photostable intramolecular charge-transfer (ICT) dyes, including energy-transfer cassettes (ETCs), that exhibit a polarity-sensitive emission, high quantum yields of up to 0.68 in nonpolar environments, high brightness (up to 121000 M-1.cm-1) and a two-photon-absorption behavior. In terms of bioimaging applications, BASHYs 81a,e were applied in the selective staining of lipid droplets in HeLa cells. Dyes 81a,e and ECT 85 were used to prepare non-cytotoxic and highly fluorescent poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) nanoparticles (NPs), which were effectively internalized by bone marrow dendritic cells (BMDC). BASHY-azide 89 was used for the site-selective labelling of Annexin V, which is an apoptosis biomarker. Annexin V-BASHY 92 successfully targeted and detected apoptotic cells maintaining high levels of specific activity.O elemento boro tem propriedades físico-químicas únicas, visto que na tabela periódica se encontra na fronteira entre o grupo dos não-metais e metais e também porque se localiza na posição adjacente ao carbono. Estas propriedades únicas do boro, despertaram o interesse da comunidade científica no desenvolvimento de novas moléculas com este elemento, a fim de ser usadas numa vasta gama de aplicações, tais como medicina, síntese de complexos dinâmicos, entre outras. Os ácidos borónicos são compostos trivalentes de boro com dois grupos hidroxilo e uma unidade alquílica ou arílica. São classificados como ácidos de Lewis fortes, tendo assim a capacidade de formar ligações covalentes dinâmicas com bases de Lewis, que contêm na sua estrutura, álcoois e aminas numa correlação vicinal (1,2) ou hominal (1,3). As ligações covalentes dinâmicas são ideais para a construção de sistemas multivalentes reversíveis, uma vez que as mesmas podem ser estáveis como ligações covalentes ou reversíveis como ligações não covalentes, dependendo do estímulo aplicado. Os sistemas multivalentes dinâmicos podem ser aplicados em diferentes áreas, tais como bioimagem, bioconjugação, terapia do cancro, entre outras. As células cancerígenas emergem a partir de células saudáveis que adquiriram mutações no ADN que não foram reparadas. Esta transformação é atualmente classificada como um processo biológico multifacetado e complexo, e por consequência, as terapias mais recentes para o tratamento do cancro, visam a interrupção do processo de carcinogénese através do uso de conjugados multifuncionais e específicos. Nesta tese de doutoramento é apresentada uma nova abordagem modular para a construção de conjugados multivalentes terapêuticos direcionados para as células cancerígenas. Estes conjugados são baseados em complexos de boro, mantidos por ligações covalentes reversíveis e contêm um agente citotóxico (bortezomib), uma cadeia hidrofílica (polietilenoglicol) e uma unidade de reconhecimento das células cancerígenas (ácido fólico). Estes complexos de boro demonstraram serem estáveis em condições biocompatíveis (ex: tempo de semi-vida do composto 72 em plasma humano = 60 h), no entanto são hidrolisados na presença da glutationa. A distribuição seletiva e libertação dos componentes destes complexos de boro nas células cancerígenas foram comprovadas através de microscopia de fluorescência confocal e foi também proposto um mecanismo para a hidrólise destes complexos de boro induzida pela glutationa com base em dados recolhidos por espectrometria de massa e cálculos teóricos. Esta nova abordagem modular permitiu a construção de conjugados multivalentes 63 e 67, que têm uma elevada seletividade para células cancerígenas MDA-MB-231 (sobre-expressão de receptores para o ácido fólico) com valores de IC50 na região do baixo nanomolar. Esta tecnologia modular foi também utilizada nesta tese de doutoramento na síntese de complexos de boro fluorescentes (BASHYs) com elevada sensibilidade e adaptabilidade em termos das suas propriedades fotofísicas. Os BASHYs foram preparados através da assemblagem modular entre ácidos borónicos e ligandos Schiff-base e revelaram possuir propriedades estruturais e fotofísicas adequadas à aplicação na área da bioimagem em células. Esta metodologia sintética modular permitiu a síntese (rendimentos até 99 %) de diversos BASHYs fotoestáveis que têm uma fluorescência dependente da polaridade, com bons rendimentos quânticos (até 0,68 em ambientes não polares), que possuem um elevado brilho (até 121000 M-1.cm-1) e cujas propriedades fotofísicas permitem a absorção de dois fotões. Relativamente às aplicações de bioimagem em células, BASHYs 81a,e foram utilizados para corar seletivamente gotículas lipídicas nas células HeLa. Sondas fluorescentes 81a,e e 85 foram usadas na preparação de nanopartículas não citotóxicas e fluorescentes que foram efetivamente internalizadas por células dendríticas da medula óssea. BASHY-azida 89 foi utilizada na conjugação com a Anexina V e o conjugado daí resultante (Anexina V-BASHY 92) foi usado com sucesso na marcação seletiva por fluorescência de células apoptóticas