Mejora de protocolos de regeneración por embriogénesis somática en pino piñonero

El pino piñonero (Pinus pinea L.) es una especie forestal nativa de la cuenca mediterránea de alto valor ecológico, como medio de protección de costas y estabilización de dunas continentales, así como económico por sus semillas comestibles. Las plantaciones forestales de producción intensiva podrían aliviar la gran demanda de productos forestales de calidad. Los programas de mejora genética en España de esta especie, considerada como frutal, se dirigen principalmente a la mejora del rendimiento de semilla mediante el cultivo en huertos injertados. Para ello sería conveniente el desarrollo de variedades de portainjertos adaptados a diferentes condiciones ambientales. La embriogénesis somática (ES) como biotecnología para la propagación clonal, se considera una herramienta indispensable en el desarrollo de variedades y plantaciones forestales. La regeneración de plantas por ES se ha conseguido en varias coníferas de interés económico, y la producción industrial en masa de embriones somáticos ha requerido el desarrollo de técnicas de cultivo en suspensión del tejido embriogénico en biorreactores. Para maximizar la eficiencia de esta biotecnología, se requiere la optimización de las condiciones de cultivo en cada una de las etapas de su desarrollo. El establecimiento de marcas epigenéticas inducidas por el medio ambiente conforma una memoria epigenética en las plantas que afecta la expresión a largo plazo de los rasgos adaptativos. La ES se podría utilizar para producir plantas con una impronta que las acondicione para responder a diferentes tipos de estrés. La metilación de las citosinas del ADN es uno de los procesos principales que subyacen a estas marcas epigenéticas. El pino piñonero se caracteriza por su muy baja variación genética pero alta plasticidad adaptativa, relacionada con altos niveles de variación epigenética. Las condiciones de cultivo, temperatura y disponibilidad hídrica, podrían modificar el perfil de metilación de citosinas en líneas embriogénicas de pino piñonero. Se ha obtenido la regeneración de plantas de pino piñonero por ES a partir de embriones cigóticos inmaduros; sin embargo, esta especie se ha mostrado recalcitrante a la respuesta embriogénica. Entre las principales limitaciones se encuentran las bajas frecuencias de inducción y su variabilidad entre años, así como la baja producción de embriones somáticos con morfología normal en las líneas embriogénicas generadas. La solución de los problemas que se plantean en las etapas de inducción, proliferación y diferenciación-maduración de embriones somáticos podría venir a través de la caracterización del explanto inicial y de las variaciones de las condiciones de cultivo habituales. La inducción de embriogénesis secundaria en embriones somáticos, procedentes de cultivos que han perdido su capacidad para formar embriones con morfología normal, podría ser un sistema de reactivación de las líneas embriogénicas. El desarrollo de cultivos en suspensión de líneas embriogénicas podría incrementar la producción de embriones somáticos. En el presente trabajo de tesis, aunque se han utilizado varias familias de semillas de polinización abierta y diferentes condiciones de cultivo, no se han podido mejorar las frecuencias de inducción previamente descritas, confirmándose la recalcitrancia del pino piñonero a la respuesta embriogénica. Se ha obtenido una ligera mejora en la producción de embriones en medios suplementados con determinados carbohidratos. El aumento de la temperatura desde la fase de proliferación a la de maduración estimuló la maduración. Cultivos mantenidos a 28ºC durante la proliferación y maduración produjeron mayor número de embriones en una de las líneas embriogénicas. La menor disponibilidad hídrica durante la proliferación redujo la producción de embriones. Las masas generadas por embriogénesis secundaria mostraron una capacidad para producir embriones similar a las masas procedentes de los cultivos envejecidos. Los cultivos embriogénicos en suspensión incrementaron la producción de biomasa. Un moderado estrés hidrodinámico y una menor concentración de reguladores durante la proliferación mejoraron la producción de embriones somáticos. El perfil de metilación del ADN, determinado por marcadores MSAP, detectó diferencias entre genotipos y entre distintas condiciones de temperatura y disponibilidad hídrica en uno de los genotipos. Algunos de los marcadores MSAP mostraron un aumento de intensidad de bandas desde las masas en proliferación a los embriones somáticos aislados, lo cual sugiere un mayor grado de desmetilación asociado con el proceso de diferenciación. ----------ABSTRACT---------- The stone pine (Pinus pinea L.) is a native forest species of the Mediterranean basin. This specie has high ecological value such as coast protection and stabilization of continental dunes, as well as economic value for its edible seeds. Intensive management forest plantations could reduce the increased demand for high-quality forest products. Genetic programs to improve this specie in Spain, considered as fruit tree, are leaded mainly to the improvement of seed yield through cultivation in grafted orchards. For this purpose, development of varieties of rootstocks adapted to different environmental conditions would be convenient. Somatic embryogenesis (SE) is a biotechnology for clonal propagation and it is considered an indispensable tool in the development of forest varieties and plantations. The regeneration of plants by SE has been achieved in several economical interesting conifers. The large-scale production of somatic embryos has required for the development of embryogenic suspension cultures in bioreactors. To maximize the efficiency of this biotechnology, it is necessary to optimize cultivation conditions at each development stages. The epigenetic marks induced by the environment factors establish an epigenetic memory in plants that affects expression of adaptive traits for long-term. SE could be used to produce primed plants conditioned to cope with different kind of stress. Cytosine methylation of global DNA is one of the main processes underlying these epigenetic marks. The stone pine is characterized by its very low genetic variation but high adaptive plasticity, related to high levels of epigenetic variation. Culture conditions as temperature and water availability, could modify the cytosine methylation profile in embryogenic lines of stone pine. Plant regeneration of stone pine by SE has been achieved through immature zygotic embryos. However, this species has been described recalcitrant to the embryogenic response. Among the main limitations are the low induction frequencies and their variability between years, as well as the low production of normal somatic embryos in the generated embryogenic lines. The problems solving of induction stage, proliferation stage and differentiation-maturation of somatic embryos could solve by characterization of the initial explant and usually variations of the culture conditions. Induction of secondary embryogenesis in somatic embryos, which have lost their capacity to produce embryos with normal morphology, could be a reactivation system of embryogenic lines. The development of embryogenic suspension cultures could increase the production of somatic embryos. In the present thesis, although several families of open-pollinated cones and different culture conditions have been used, the previously described induction frequencies have not been improved. It has been confirmed the stone pine recalcitrance to the embryogenic response. A slight improvement in the production of embryos has been obtained on media supplemented with some carbohydrates. The increase in temperature from proliferation phase to maturation phase stimulated somatic embryo maturation. Embryogenic cultures maintained at 28ºC during proliferation and maturation phases produced a greater number of embryos in one embryogenic line. The lower water availability during proliferation phase reduced embryos production. The embryogenic masses generated by secondary embryogenesis showed a similar embryo production ability that the aged cultures. Embryogenic suspension cultures increased biomass production. Moderate hydrodynamic stress and lower concentration of PGRs during proliferation phase improved the somatic embryos production. DNA methylation profile detected by MSAP markers, showed differences between genotypes and between different temperature conditions and water availability in one genotype. Some of the MSAP markers associated with development showed an increase in intensity of the bands from proliferation masses to isolated somatic embryos, suggesting a greater degree of demethylation associated with differentiation processes