SOD1 felveckning och aggregering i ALS : i fokus för strukturspecifika antikroppar

Mutations in the superoxide dismutase 1 (SOD1) gene are linked to the progressive neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS). ALS-associated mutations affect the stability of the SOD1 protein and promote its unfolding. As a consequence, disordered SOD1 species can misfold and accumulate into insoluble aggregates. Cytoplasmic inclusions containing misfolded SOD1 are a hallmark of ALS pathology in patients as well as transgenic mouse models. However, it remains unclear, which SOD1 species are pathogenic and how they arise and contribute to the disease. The aim of this thesis was to use antibodies as tools to study the role of disordered and aggregated SOD1 species in ALS. These antibodies recognize epitopes exposed in disordered SOD1 species and hence, discriminate between natively folded SOD1 and the disordered or misfolded protein. SOD1 is expressed in all cell types, but aggregates of misfolded SOD1 are predominantly found in motor neurons and associated glial cells in the spinal cord of ALS patients. To understand why misfolded SOD1 targets the motor system, we used ELISA and immunocapture methods to quantify soluble SOD1 species in patient-derived cell models of ALS. The highest levels of soluble disordered SOD1 were detected in induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived motor neuron and astrocytes cultures (MNACs) compared to fibroblasts, iPSCs and sensory neuron cultures. These results suggest that the selective vulnerability of motor areas to SOD1-ALS could derive from an enhanced burden of disordered SOD1. To understand factors that might promote SOD1 unfolding, we focussed on the disulfide bond that is required for the stability of natively folded SOD1. Formation of the bond is oxygen-dependent and reduction of the bond promotes SOD1 unfolding. We studied the stability of SOD1 in patient-derived cells exposed to lowered oxygen tensions. This induced increases in disulfide-reduced, disordered mutant and wild-type SOD1. The response was time- and concentration-dependent and more pronounced in MNACs, where even increased aggregation of mutant SOD1 was observed. These results are consistent with the enhanced vulnerability of the motor system in ALS and suggest that conditions causing impaired oxygen perfusion could contribute to the initiation and progression of the disease. Inclusions containing aggregated misfolded wild-type SOD1 have been found in sporadic ALS (sALS) patients without SOD1 mutations and those carrying mutations in genes other than SOD1. However, other groups have reported contrasting results and the contribution of misfolded wild-type SOD1 to ALS pathology is controversial. Guidelines for preservation, storage, and analysis of tissues under standardized conditions would facilitate the comparison of results between different laboratories. We established an optimized immunohistochemistry protocol to detect misfolded wild-type SOD1 in paraffin-embedded spinal cord samples from sALS patients. We also developed a method to immunocapture disordered SOD1 from frozen post-mortem tissue. High, but variable, levels of disordered SOD1 were detected in spinal cords from sALS patients. Our data support a possible pathological role of misfolded wild-type SOD1 in sALS. Recent evidence suggests that SOD1 aggregates can induce templated aggregation of disordered SOD1 and spread from cell-to-cell via a prion-like mechanism. To test if antibodies could block this process in vivo, we conducted an immunotherapy study in a model of prion-like spread, where SOD1 aggregate seeds are inoculated into the lumbar spinal cord of SOD1G85R transgenic mice and lead to accelerated disease onset and progression. Novel monoclonal antibodies (mAb) against disordered domains of SOD1 aggregates were developed and validated for their reactivity to disordered and aggregated SOD1 species in vitro and in vivo. Immunotherapy using a mAb against the C-terminal end of SOD1 attenuated the onset and progression of prion-like SOD1 spread. However, no effect was seen on onset, duration or progression of the underlying disease. This suggests that, under the conditions tested, immunotherapy against disordered domains of SOD1 does not affect intracellular aggregation and additional strategies might be needed to reduce intracellular accumulation of misfolded SOD1 aggregation. In conclusion, we show that conformation-specific antibodies are powerful tools to investigate disordered and potentially pathogenic species of SOD1 in various biochemical, cellular and in vivo contexts. The development of the novel immunocapture strategy could facilitate future research on characterizing SOD1 aggregates from mouse tissues, patient-derived cells or post-mortem tissues with the goal of determining their role in ALS disease pathogenesis.Mutationer i superoxiddismutas 1 (SOD1) genen kan orsaka den progressiva neurodegenerativa sjukdomen Amyotrofisk lateralskleros (ALS). ALSassocierade mutationer påverkar stabiliteten hos SOD1-proteinet och gör att det förlorar sin naturliga struktur. Det ostrukturerade muterade proteinet kan sedan fel-veckas och aggregera. Ansamlingar av aggregerat SOD1 protein i drabbade motoriska nervceller är ett välkänt fenomen, både hos patienter samt i transgena musmodeller för SOD1-ALS. Syftet med denna avhandling var att utveckla och karaktärisera nya antikroppar och metoder för att studera hur, och varför dessa sjukdomsassocierade SOD1 aggregat bildas, ansamlas och sprider sig vid ALS. Vårt slutgiltiga mål var att identifiera en antikropp som kunde användas för immunterapibehandling för att bromsa sjukdomen SOD1 protein uttrycks i kroppens alla celltyper. Varför är det då specifikt ryggmärgens, och hjärnans motoriska nervceller och de omkringliggande stödjecellerna (astrocyter) som påverkas vid ALS, och bara där som aggregat av felveckat SOD1 bildas? För att förstå varför muterat SOD1 är specifikt farligt för motorsystemet odlade vi celler från ALS patienter i vårt laboratorium, och använde biokemiska metoder för att mäta mängden lösligt ostrukturerat SOD1 protein i olika celltyper. De högsta nivåerna av lösligt ostrukturerat SOD1 detekterades i celler som omprogrammerats till pluripotenta stamceller (iPSC), och sedan differentierats ut till motoriska nervceller och astrocyter. Vi jämförde med fibroblaster, iPSCs och iPSCs deriverade sensoriska nervceller. Våra resultat tyder på att den selektiva sårbarheten hos motorsystemet vid SOD1-ALS skulle kunna härledas till en ökad ansamling av ostrukturerat SOD1 protein i motoriska nervceller och astrocyter. Vilka mijöfaktorer skulle kunna bidra till att SOD1 tappar sin naturliga struktur och börjar bilda aggregat? Här fokuserade vi på en disulfidbrygga som stärker stabiliteten hos normal-veckat SOD1 protein. Disulfidbryggan är syreberoende och reduktion av denna leder till ökad sannolikhet att SOD1 proteinet tappar sin normala struktur, kan fel-veckas och bilda aggregat. Vi studerade hur låg syrehalt påverkade disulfidbryggan och mängden ostrukturerat SOD1 i celler från patienter. Låg syrenivå ledde till reducerad disulfidbindning, och ökad mängd ostrukturerat SOD1 protein. Både celler med ALS-länkade mutationer i SOD1, och med normalt vildtypsprotein, påverkades av lågt syre, och effekten var tid- och koncentrationsberoende. Motoriska nervceller och astrocyter påverkades mest, och i dessa celler ledde låg syrehalt även till aggregering av mutant SOD1. Dessa resultat bidrar till att förklara motorsystemets sårbarhet vid ALS, och föreslår att tillstånd som orsakar nedsatt syresättning i nervsystemet kan bidra till sjukdomsutveckling. Flera studier har rapporterat att det även bildas aggregat av felveckat vildtypsSOD1 i vävnad från patienter med sporadisk ALS (sALS), och patienter med mutation i andra ALS-länkade gener, utan SOD1-mutationer. Andra studier har dock rapporterat motsatt resultat, så både förekomst och betydelse av aggregerat vildtyps-SOD1 är kontroversiellt. Vi har sammanställt gemensamma riktlinjer för fixering, lagring och analysprotokoll som skulle kunna underlätta jämförelsen av resultat från olika laboratorier. Vi beskriver i detalj ett etablerat, optimerat immunohistokemiprotokoll för att färga aggregerat vildtyps-SOD1 i vävnadssnitt från från sALS-patienter. Vi har också utvecklat en antikroppsbaserad metod för att detektera sjukdomsassocierat SOD1 i homogeniserad frusen ryggmärgsvävnad. Höga, men varierande, nivåer av ostrukturerat och felveckat SOD1 detekterades i vävnad från sALS-patienter. Våra resultat stöder hypotesen att felveckat vildtyps-SOD1 kan bidra till sjukdomsutveckling hos ALS-patienter utan SOD1 mutation. Med mål att utveckla immunterapi mot SOD1-ALS producerade, och karaktäriserade vi monoklonala antikroppar som specifikt binder sjukdomsassocierat SOD1 protein. Tidigare studier tyder på att SOD1 aggregat kan få ostrukturerat SOD1 protein att börja aggregera och spridas från cell till cell via en prion-liknande mekanism. Vi använde en musmodell för ALS, som bygger på att en liten mängd aggregerat SOD1 injiceras i ryggmärgen hos transgena möss och leder till prion-liknande spridning av SOD1 aggregat, och progressiv ALSliknande förlamning. Immunoterapibehandling med hjälp av en av våra monoklonala antikroppar som binder den C-terminala änden av SOD1 kunde binda SOD1 aggregat in vivo, dämpade SOD1-aggregatens aktivitet och förlängde mössens överlevnad. Immunterapi behandling kunde däremot inte hämma start, progression eller förlänga överlevnad hos transgena möss som uttrycker muterat humant SOD1 och utvecklar ALS-liknande förlamningssjukdom. Våra resultat tyder på att antikroppsbaserad behandling kan bromsa extracellulär spridning av SOD1 aggregat men har svårt att komma in i motoriska nervceller och förhindra intracellulär SOD1 aggregering. Sammanfattningsvis visar vi att strukturspecifika antikroppar är kraftfulla verktyg för att undersöka ostrukturerat och patogena arter av SOD1 protein i olika biokemiska, cellulära och in vivo studier. Utvecklingen av nya antikroppar och metoder kan underlätta ny forskning om de cellulära mekanismer som påverkar bildningen av patogena arter av SOD1 aggregat och nervcells död vid ALS