Production of the sweetener erythritol by Yarrowia lipolytica strains

Dissertação de mestrado em BiotechnologyNowadays, the demand for alternatives to sugar has become a priority. Erythritol is a sugar alcohol with nearly 70 % of sucrose sweetness, with zero calories, non-cariogenic and non-glycemic. This sweetener is produced through fermentation from glucose mostly by osmophilic microorganisms. The osmotolerant yeast Yarrowia lipolytica can produce erythritol from crude glycerol, a by-product of biodiesel industry. The production of erythritol by this yeast can be affected by several parameters, such as yeast strain, medium composition and operating condition. The main objective of the present work was the development of a process for erythritol production by Y. lipolytica using crude glycerol as carbon source. Initially, a screening for osmotolerant strains of Y. lipolytica was performed using two different methodologies: assessment of cell growth in agar plates containing 1 M of NaCl and miniaturized assays in liquid medium supplemented with NaCl. Nine strains that grew better in the medium with salt were selected and their capability to produce erythritol was tested. The strains W29, UV15-31, UV15-93 and EMS75-162 produced the higher concentrations of erythritol. The scale-up of the process in a stirred tank reactor was performed only with the strain Y. lipolytica W29. The effect of dissolved oxygen in the production of erythritol was assessed, using two different strategies: constant aeration and stirring rates and controlled dissolved oxygen concentration. The results showed that dissolved oxygen concentration in the medium is an important parameter that influences the erythritol productivity. The highest concentration of erythritol (32 g·L-1), yield (0.43 g·g-1) and productivity (0.44 g·L-1·h-1) were obtained in the batch performed at high constant stirring and aeration rates, 900 rpm and 3 vvm, respectively. Some strategies of fed-batch operation were also performed to evaluate if the erythritol production could be extended with glycerol feeding to Y. lipolytica culture. The different strategies tested were fed-batch at constant feeding rates with completed and concentrated medium, fed-batch at constant feeding rate only with addition of crude glycerol, and a step-wise fed-batch with the addition of crude glycerol. It was observed that erythritol accumulation in the medium was extended with the addition of only crude glycerol to the bioreactor. The step-wise fed-batch proved to be the best strategy among the tested ones, leading to highest yield (0.42 g·g-1) and productivity (0.45 g·L-1·h-1).Atualmente, a procura por alternativas ao açúcar tornou-se uma prioridade. O eritritol é um álcool de açúcar com cerca de 70 % da doçura da sacarose, com zero calorias, não-cariogénico e não-glicémico. Este adoçante é produzido através da fermentação da glucose maioritariamente por microrganismos osmofílicos. A levedura osmotolerante Yarrowia lipolytica consegue produzir eritritol, usando como fonte de carbono o glicerol bruto, um subproduto da indústria do biodiesel. A produção de eritritol por esta levedura pode ser influenciada por diversos parâmetros, tais como a estirpe de levedura utilizada, a composição do meio e as condições de operação. O principal objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de um processo para a produção de eritritol pela levedura Y. lipolytica, usando-se glicerol bruto como fonte de carbono. Inicialmente, foi realizado um rastreio para estirpes osmotolerantes de Y. lipolytica, usando duas metodologias diferentes: avaliação do crescimento celular em meio com sal em placas de agar e em microplacas usando meio líquido. Nove estirpes, que apresentaram um melhor crescimento nos meios com sal, foram selecionadas para avaliar a sua capacidade de produção de eritritol, sendo que as estirpes W29, UV15-31, UV15-93 e EMS75-162 produziram eritritol em maiores concentrações. O aumento de escala do processo num reator de tanque agitado foi realizado apenas com a estirpe W29. Foi avaliado o efeito do oxigénio dissolvido na produção de eritritol usando 2 estratégias diferentes: taxas de agitação e arejamento constantes e concentração de oxigénio dissolvido constante. Observou-se que a concentração de oxigénio dissolvido no meio é um parâmetro importante com influência na produtividade de eritritol. A concentração mais elevada de eritritol (32 g·L-1), o maior rendimento (0.43 g·g-1) e a maior produtividade (0.44 g·L-1·h-1) foram obtidos no ensaio em modo descontinuo realizado com taxas de agitação (900 rpm) e arejamento (3 vvm) constantes. Foram ainda exploradas algumas estratégias de operação em semi-contínuo para avaliar se a produção de eritritol poderia ser prolongada com a adição de glicerol. As diferentes estratégias testadas foram modo semi-contínuo com taxas de alimentação constantes com meio completo e concentrado, com taxa de alimentação constante com a adição de apenas glicerol bruto, e um modo descontínuo repetido com a adição pontual de glicerol bruto. Observou-se que a acumulação de eritritol no meio foi prolongada com a adição de apenas glicerol bruto. O modo descontínuo repetido demonstrou ser a melhor estratégia, obtendo–se o rendimento (0.42 g·g-1) e a produtividade (0.45 g·L-1·h-1) mais elevados