Inserzione di canali ionici in matrici lipidiche (II)

Inserzione di canali ionici in matrici lipidiche (II). I canali di membrana giocano un ruolo fondamentale nei meccanismi biologici. La determinazione delle loro propriet\ue0 microscopiche \ue8 molto importante al fine di comprendere le loro reali propriet\ue0 e funzioni nelle membrane delle cellule viventi. Scopo di questa ricerca \ue8 stato lo studio delle condizioni ottimali per l'inserimento di porine mitocondriali in doppi strati lipidici di fosfatidilinositolo (PI) e di colesterolo ossidato (OC). Il doppio strato lipidico \ue8 stato formato sul foro di una parete che separa due compartimenti (riempiti con soluzioni di KCl) in una cella di Teflon e la variazione dei parametri elettrici \ue8 stata seguita mediante corrente alternata. Dai dati sperimentali si sono tratte le seguenti conclusioni: 1) le membrane di OC (lipide neutro) hanno valori di conduttanza e di capacit\ue0 maggiori rispetto a quelli delle membrane di PI (lipide carico negativamente); 2) le membrane di OC non presentano grandi variazioni dei valori di conduttanza in tutto l'intervallo di concentrazioni di KCI preso in esame (0-1 M); discorso analogo vale per i valori di capacit\ue0; 3) le membrane di PI non mostrano variazioni significative dei due parametri, per concentrazioni di KCl comprese tra 0,3 M e 1,0 M (in questo intervallo di concentrazioni la conduttanza va da un minimo di 2,03\ub10,21 microS/cm2 ad un massimo di 2,40\ub10,35 microS/cm2; la capacit\ue0 va da un minimo di 207,7\ub111,9 nF/cm2 ad un massimo di 255,9\ub18,0 nF/cm2); si nota invece una spiccata dipendenza della conduttanza e della capacit\ue0 per concentrazioni di KCl inferiori; 4) i valori dell'angolo di fase oscillano tra un minimo di 0,526\ub10,042 rad ed un massimo di 0,669\ub10,025 rad per le membrane di PI, e tra un minimo di 0,577\ub10,029 rad ed un massimo di 0,666\ub10,031 rad per le membrane di OC; non si notano quindi differenze significative tra i due tipi di membrane; 5) le cinetiche di incorporazione delle molecole di porina nelle membrane di PI sono a forma di S, indipendentemente dalle condizioni sperimentali; la formazione dei canali \ue8 pi\uf9 veloce e raggiunge livelli di steady-state pi\uf9 elevati se la porina \ue8 aggiunta dopo la formazione della membrana; 6) la cinetica di incorporazione nelle membrane di OC assume forma a S quando la porina \ue8 aggiunta dopo che si \ue8 formata la membrana; se invece essa \ue8 gi\ue0 presente in soluzione, la cinetica ha un andamento di tipo esponenziale; 7) l'incorporazione dei canali di porina \ue8 pi\uf9 veloce e raggiunge valori di stato stazionario pi\uf9 elevati se avviene in una membrana di OC, rispetto ad una di PI nelle stesse condizioni; 8) a parit\ue0 di potenziale imposto, le cinetiche di incorporazione della porina sono pi\uf9 rapide e raggiungono valori di stato stazionario pi\uf9 elevati aumentando la concentrazione proteica in soluzione: sia nelle membrane di PI sia in quelle di OC; 9) le membrane di OC incorporano pi\uf9 facilmente canali di porina rispetto alle membrane di PI; usando per\uf2 concentrazioni di porina molto elevate (oltre 10 ng/ml) si assiste ad una specie di "auto-inattivazione" della porina stessa: la cinetica rallenta e il valore di stato stazionario diminuisce; 10) la d.d.p. influenza significativamente l'incorporazione della porina. I due tipi di lipidi utilizzati portano alla formazione di strutture membranarie con differenti comportamenti. Il PI determina la formazione di membrane molto stabili. Poich\ue9 invece il colesterolo naturale non \ue8 stabile, si ricorre al OC, miscela di diversi lipidi. I due lipidi presentano una diversa distribuzione delle cariche elettriche, fattore importante per le interazioni tra la porina e la membrana. L'incorporazione nelle membrane di PI, data la sua carica negativa, risulta pi\uf9 difficoltosa. \uc8 stato infatti appurato che la cinetica \ue8 sempre sigmoidale e tende a rallentare nelle seconde membrane (quelle formate con la proteina gi\ue0 presente in soluzione). Nelle prime membrane di OC la cinetica \ue8 indubbiamente pi\uf9 veloce rispetto a quella con membrane di PI e nelle seconde diventa esponenziale. Sembra quindi che le interazioni elettrostatiche giochino un ruolo fondamentale anche nelle differenze di comportamento riscontrate tra prime e seconde membrane. Indipendentemente dalle condizioni sperimentali adottate l'incorporazione dei canali di porina tende sempre ad uno stato stazionario, ovvero ad una situazione in cui il numero dei canali aperti e funzionanti \ue8 costante. In entrambi i tipi di membrane \ue8 stato osservato che aumentando la concentrazione di porina si ottiene un aumento delle velocit\ue0 di incorporazione ed anche valori pi\uf9 elevati della conduttanza allo stato stazionario. Nelle membrane di PI l'incorporazione giunge a saturazione per valori di concentrazione proteica relativamente bassi (60-90 ng/ml), aumentando i quali si ottiene una cinetica pi\uf9 rapida ma valori di stato stazionario costanti. Nel caso di membrane di OC invece si giunge a valori di stato stazionario costanti per concentrazioni proteiche notevolmente inferiori (5-8 ng/ml); la cinetica di incorporazione \ue8 pi\uf9 rapida e quindi lo stato stazionario \ue8 raggiunto pi\uf9 velocemente. Il valore della conduttanza, e quindi il numero dei canali incorporati e aperti nella membrana lipidica, dipende da due fattori fondamentali: la concentrazione proteica e la composizione della membrana. La valutazione della dipendenza della conduttanza dal voltaggio, indipendentemente dalla sua origine, potrebbe dimostrarsi utile ai fini di realizzare dei semiconduttori organici, montati appositamente su idonei supporti solidi. La formulazione di questi sensori organici, che potrebbero reagire a variazioni di potenziale elettrico o ad alterazioni del mezzo in cui sono posti, potrebbe portare ad innovazioni nel campo dell'elettronica e dell'informatica o al loro utilizzo come biosensori. I risultati sperimentali mostrano la possibilit\ue0, variando opportunamente le condizioni sotto cui si realizza l'incorporazione proteica, di realizzare strutture organiche (lipidi + proteine) con caratteristiche elettriche predeterrninate. Il problema ancora da risolvere \ue8 quello relativo alla stabilit\ue0 nel tempo in quanto \ue8 emerso che in seguito all'incorporazione delle molecole proteiche nel doppio strato lipidico, il doppio strato stesso risulta meno stabile e quindi pi\uf9 suscettibile di rottura