Epidemiology of the esca related fungus Phaeomoniella chlamydospora and a new control method by using electrospun polymers

Die Esca Krankheit hat sich in den letzten Jahrzehnten zu einer globalen Bedrohung für den Weinbau entwickelt. Als Hauptverursacher gilt dabei ein Komplex aus mindestens drei holzbewohnenden Pilzen: Phaeomoniella chlamydospora (Pch), Phaeoacremonium aleophilum (Pal), und Fomitiporia mediterranea (Fmed). Als Hauptinfektionsweg für diese Pilze werden Wunden am Holz angenommen, die den Reben besonders während des Winterschnitts zugefügt werden. Bisher gibt es keine effektiven Kontrollmechanismen gegen Esca. Das Hauptziel dieser Arbeit war deshalb einen neuartigen Wundverschluss aus elektrogesponnenen Fasern zu testen, der auf die Schnittwunden appliziert werden und als physikalische Barriere gegen eindringende Sporen wirken soll. Zur Beurteilung, ob eine solche Maßnahme erfolgversprechend sein kann, wurde die Epidemiologie des Erregers Pch genauer untersucht, da dieser Erreger die Rebe bereits im Pflanzgutstadium infizieren kann. Zu diesem Zweck wurden verschiedene molekularbiologische Verfahren entwickelt um Pch sicher nachweisen und differenzieren zu können. Für die epidemiologische Untersuchung wurde der Fokus auf das Sporenaufkommen von Pch im Weinberg gelegt. Hierfür wurden Fallen in Rebanlagen des Julius Kühn-Institutes in Siebeldingen sowohl in Anlagen mit chronischem Esca Befall, als auch in optisch symptomfreien Anlagen aufgehängt. Diese wurden über einen Zeitraum von drei Jahren wöchentlich untersucht. In dieser Arbeit wurde ein neues Verfahren entwickelt, um die Sporenfallen mittels Pch-spezifischer Nested-PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion) zu untersuchen, anstatt wie üblich die gefangenen Sporen auszuplattieren und zu zählen. Die Nested-PCR erwies sich als eine schnelle, zuverlässige und sensitive Nachweismethode, mit der Pch erstmals ganzjährig in einer deutschen Rebanlage nachgewiesen werden konnte. Insgesamt konnten Sporen des Pilzes über den gesamten Versuchszeitraum nachgewiesen werden. Darüber hinaus wurde eine Sammlung von 16 Pch Stämmen, mit Herkunft aus Deutschland, Italien und Südafrika, mittels eines Sets aus 17 RAMS (Random Amplified Microsatellites)-Primern untersucht um einzelnen Stämmen Haplotypen zuzuordnen. Bei der Analyse der Stammsammlung mit RAMS-Primern fielen Muster auf, die als Längenpolymorphismus gedeutet werden konnten. Die Sequenzanalayse ergab, dass es sich hier tatsächlich um Längenpolymorphismen handelte und diese aus unterschiedlich langen Repeats einer Sequenz bestanden. Die Kombination von RAMSPrimern und anschließender Sequenzanalyse ermöglichten es die Stämme weiter zu differenzieren. Aus den Sequenzen konnten zudem Primer entwickelt werden, die eine direkte Analyse der einzelnen Stämme ermöglichte ohne eine vorherige RAMS-Analyse durchzuführen. Final konnten bei den 16 untersuchten Stämmen zehn Haplotypen und zwei Cluster mit jeweils drei Stämmen identifiziert werden. Eine eindeutige Zuordnung der Stämme zu ihrem geographischen Ursprung, die Rückschlüsse auf die Ausbreitungswege des Pilzes hätte geben können, war jedoch nicht möglich. Die mittels RAMS-Methode gefundenen Marker wurden anschließend verwendet, um die in den Sporenfallen gefunden Pilzsporen genauer zu klassifizieren. Zudem wurden die Sporen aus der Luft mit Proben aus Reben in den Anlagen verglichen, um einen Eindruck zu gewinnen ob die Sporen von Pilzen aus den Reben der Anlage oder aus anderen Quellen stammen. Die direkte Analyse mittels der neuen entwickelten Primer konnte in ersten Versuchen erfolgreich für die Auswertung der Sporenfallen verwendet und verschiedene Stamm-Gruppen von Pch nachgewiesen werden. Für eine exakte Zuordnung von Haplotypen müssen jedoch weitere Polymorphismen und Primerpaare gefunden werden, die sich für die Sporenfallenanalyse eignen. Die epidemiologischen Untersuchungen zeigten deutlich, wie wichtig ein Wundverschluss für die Schnittwunden nach dem Rebschnitt sein kann, da Sporen in der Luft zu jeder Jahreszeit und insbesondere auch zur Zeit des Winterschnitts nachgewiesen werden können. Für den Wundverschluss wurden verschiedene elektrogesponnene Fasermatten aus milchsäurebasierten Polymeren in Labor- und Gewächshausversuchen auf ihre Dichtigkeit gegen Pch-Sporen untersucht. Bei den Dichtigkeitstests im Gewächshaus konnte zudem die neu entwickelte Nested-PCR eingesetzt werden um eine bestehende Vorinfektion der Pflanzen im Rahmen der Nachweisgenauigkeit auszuschließen sowie im Falle einer Neuinfektion zu bestätigen, dass sie tatsächlich durch den der applizierten Pch-Stamm erfolgt ist. Auch die Beständigkeit und das Abbauverhalten der Materialien wurden im Labor und Weinberg untersucht. Hierbei erwiesen sich Vliese mit einem erhöhten Glycolsäureanteil als weniger stabil. Unter den geprüften Materialien stellten sich die Faservliese basierend auf reiner Milchsäure als grundsätzlich geeignet heraus, um einen gut applizierbaren und infektionsdichten Wundverschluss herzustellen. Erste Ansätze mit diesem Vlies im Freiland bestätigten dieses gute Ergebnis, die langfristige Auswirkung dieser Maßnahme auf die Inzidenz der Esca-Erkrankung in den Weinbergen muss überprüft werden.Esca disease has become a global thread for viticulture over the last decades. It is caused by a complex of at least three different wood-inhabitating fungi Phaeomoniella chlamydospora (Pch), Phaeoacremonium aleophilum (Pal), und Fomitiporia mediterranea (Fmed). For all these fungi wounds in wood are seen as the main entrance way, especially pruning wounds, which are caused by winter pruning. Currently, there are no effective control mechanisms available Therefore, it was the main aim of this project to test a new wound closure made of electrospun fibers, which shall be applied on the pruning wounds to build a physical barrier against invading spores. For evaluating the effectiveness of this treatment the epidemiology of the fungus Pch was investigated, as this fungus is one of the first of this complex invading the vine. For this purpose new molecular techniques have been developed to identify and differentiate Pch reliably. For epidemiologic studies the focus was placed on the occurrence of spores of Pch in the vineyards during the year. Spore traps were placed in vineyards of the Julius Kühn-Intitute which were showing severe symptoms of Esca and in vineyards which were free of foliar symptoms. Traps were analyzed during the whole three year project period on a weekly basis. In this study a new method was developed using a Pch- specific Nested-PCR (polymerase chain reaction) to analyze the spore traps instead of the usual method, in which the trapped spores are spread on media and counting germinated spores. The new Nested-PCR turned out to be a very fast, reliable and sensitive method. It was the first time Pch could be detected in a German vineyard year round. Spores of this fungus could be detected over the whole trial period. Furthermore, a collection of 16 Pch strains with origins from Germany, Italy and South Africa was analyzed using a set of 17 RAMS (random amplified microsatellites) primer to link each one with a unique haplotype. By using this method some polymorphisms formed a pattern which could be interpreted as length polymorphisms. Further analyses of the sequences showed that there are in fact length polymorphisms which are based on repeats of the same sequence. The combination of RAMS primers and the sequence analysis resulted in a finer differentiation of isolates. Primers were developed flanking these repetitive sequences to detect polymorphisms directly without a previous RAMS-analysis. In the end ten haplotypes and two clusters each containing three isolates were found. However, it was not possible to link haplotypes to their geographical origin to gain knowledge of the spread of the fungus. Markers found using the RAMS-analysis were used to differentiate the fungal spores trapped in the spore traps. Furthermore, spores were also compared with strains found in vines of the same vineyard to verify, if the spores were possibly released by fungi in the plants or if they had a different source. This direct analysis was successful in first trials and proofed the existence of different strains in the traps. For an exact classification more markers and primer pairs have to be developed suitable for analyzing spore traps. The epidemiologic survey of this pathogen clearly shows the necessity of a good working wound closure which has to be applied directly after pruning, as the spores are present all year round and especially at the time of winter pruning. For this purpose, different electrospun fibermats made of different fibers of lactic acid were tested under laboratory conditions and in greenhouses for their impermeableness against spores of Pch. During these tightness tests in the greenhouse the new developed Nested-PCR was used to exclude, within the scope of its detection limits, an already exiting infection of the tested plants and to confirm that the a new infection was caused by the applied strain of Pch. Furthermore the degradation and aging of the materials was tested under laboratory and field conditions. Fiber mats with an added amount of glycolic acid turned out to be less stable. Among the different materials fiber mats based on pure lactic acid turned out to be principally suitable to build an applicable and efficient wound closure. First trials in the vineyard confirmed this positive result. However, the long term effect of this treatment on the incidence of Esca disease in vineyards has to be proven