Enzimi di rimodellamento della parete cellulare quali potenziali target per antifungini

La formazione della parete, esoscheletro essenziale per la vita dei funghi, dipende dalla costruzione di una rete di beta-(1,3)-glucano alla quale si legano gli altri costituenti quali le mannoproteine e la chitina. Diverse attivit\ue0 enzimatiche concorrono al processo di costruzione della parete e ai suoi dinamici cambiamenti in risposta a stimoli morfogenetici, a condizioni ambientali avverse, all\u2019interazione con le cellule dell\u2019ospite o al trattamento con farmaci antifungini. Molti enzimi presiedono alla biosintesi, degradazione e rimodellamento della parete. Gli enzimi appartenenti alla famiglia GH72 (database CaZy) svolgono una funzione essenziale poich\ue9 tagliano e rilegano fra loro porzioni di beta-(1,3)-glucano, conferendo alla parete la resistenza richiesta per accompagnare processi fondamentali quali la crescita polarizzata e l\u2019allungamento delle ife. L\u2019assenza di questi enzimi determina aberrazioni morfologiche, incapacit\ue0 di sostenere la crescita apicale e avirulenza nei funghi patogeni per l\u2019uomo testati in modelli animali d\u2019infezione fungina sistemica. Gli enzimi GH72 sono ancorati alla membrana plasmatica attraverso un glicolipide (GPI). Sono presenti sotto forma di famiglie multigeniche in tutte le specie fungine la cui sequenza genomica \ue8 stata annotata ma sono assenti nell\u2019uomo. Tra le famiglie piu\u2019studiate vi sono la famiglia GAS del lievito Saccharomyces cerevisiae (5 geni), la famiglia GEL del fungo patogeno Aspergillus fumigatus e la famiglia PHR di Candida albicans, a cui appartengono 5 geni: PHR1, PHR2, PHR3, PGA4 e PGA5. Per caratterizzare le funzioni di queste proteine, capire il significato della loro ridondanza e valutare il loro potenziale uso quali target per nuovi antifungini abbiamo intrapreso diversi studi mirati a localizzare le proteine nella cellula e alla messa a punto di metodi per saggiare la loro attivit\ue0 in modo semplice. Gli studi delle propriet\ue0 biochimiche basilari delle varie isoforme enzimatiche sono utili in previsione di possibili applicazioni quali l\u2019allestimento di saggi cell-free in formato micro-titer da utilizzarsi per la ricerca di inibitori. La proteina Phr1, sotto forma di ibrido con la GFP (Phr1-GFP), si localizza nella gemma in espansione, all\u2019apice delle ife e nel setto di divisione. L\u2019attivit\ue0 GH72 \ue8 quindi richiesta nei siti dove avviene un\u2019intensa sintesi di nuova parete cellulare. Abbiamo perturbato la formazione del setto attraverso l\u2019uso di un inibitore della chitina sintasi 1 (Chs1p), enzima essenziale in C. albicans, e concluso che la proteina Phr1p si localizza lungo tutto lo spessore del setto di divisione in stretta dipendenza con la formazione del disco di chitina ai due lati del quale si deposita nuova parete. Per lo studio delle propriet\ue0 biochimiche abbiamo sviluppato un saggio fluorescente per la determinazione dell\u2019attivit\ue0 transferasica utilizzando le proteine Phr prodotte via DNA ricombinante in un organismo eterologo e purificate