REACTIVE OXYGEN SPECIES, OXIDATIVE DAMAGE, AND ANTIOXIDANT DEFENSE MECHANISMS: IN HUMANS AND IN VITRO ELECTRON PARAMAGNETIC RESONANCE SPIN-TRAPPING STUDIES

Scopo della ricerca sviluppata durante questi tre anni di Dottorato \ue8 quello di spiegare i meccanismi sottesi alla risposta allo stress ossidativo nell'uomo a livello integrativo e molecolare. Per questo fine, nel primo anno di Dottorato, si \ue8 innanzi tutto implementato un metodo quantitativo assoluto atto a valutare la produzione dei radicali liberi. Come \ue8 noto ci\uf2 che importa \ue8 l\u2019equilibrio tra produzione di Specie Reattive dell\u2019Ossigeno (ROS) e la disponibilit\ue0 di difese antiossidanti. Quando questo equilibrio viene meno, si parla di Stress Ossidativo, con conseguenze a carico degli acidi nucleici, dei lipidi e delle proteine, compromettendo il metabolismo e la vitalit\ue0 cellulare, fino a indurre apoptosi o necrosi. Questo \ue8 un fenomeno ricorrente in molte malattie acute e croniche oltre che nel fisiologico processo di invecchiamento. Allo scopo si \ue8 utilizzata la tecnica di Risonanza Paramagnetica Elettronica (EPR) accoppiata a specifiche sonde molecolari (spin trapping) per sviluppare un metodo quantitativo \u201cin vivo\u201d in grado di monitorare la produzione di ROS in campioni biologici quale il sangue e sue frazioni. Gli inizi del mio periodo di Dottorato sono fortunatamente coincisi con l\u2019acquisizione da parte dell\u2019Istituto di Bioimmagini e Fisiologia Molecolare (IBFM) del CNR (Lita di Segrate), di uno strumento EPR che risponde alle esigenze di maneggevolezza e portabilit\ue0 (e-scan Bruker BioSpin, Germania), di recente immissione sul mercato, che opera in onda continua (CW), nella banda X delle \ub5W, in grado di rilevare concentrazioni molto basse (nM) in piccoli campioni (50 \ub5l), utilizzando una cavit\ue0 risonante le cui propriet\ue0 ottimizzano il fattore di riempimento, conferendo un\u2019elevata sensibilit\ue0 allo strumento. L\u2019attendibilit\ue0 dell'efficacia del metodo sviluppato \ue8 stata verificata con correlazioni tra metodi classici enzimatici e misure EPR in vari stati: fisiologici e parafisiologici. Trattandosi della messa a punto di un metodo di misura completamente innovativo e mancando pertanto dati di letteratura cui fare riferimento, si sono rese necessarie molte prove sperimentali da campioni ematici, in un vasto gruppo di soggetti, con tantissime acquisizioni modificando e ottimizzando di volta in volta i parametri e le condizioni (T, pO2) Questo procedimento \ue8 stato lento e laborioso; una volta superate le difficolt\ue0 tecniche, si \ue8 avuto a disposizione un piccolo catalogo di misurazioni che \ue8 servito ad ottenere i primi dati sperimentali che saranno illustrati nei primi paragrafi di questa tesi. Si \ue8 inoltre cercata una correlazione statistica tra la produzione di ROS determinata con tecnica EPR ed i marcatori dello stress ossidativo ottenuti dai vari test convenzionali enzimatici riportati in letteratura quali il dosaggio da sostanze reattive all'acido tiobarbiturico (TBARS) e carbonili proteici (PC) in grado di quantizzare il danno \u201ca posteriori\u201d prodotto dai ROS su lipidi e proteine rispettivamente. Una correlazione sistematica tra i dati EPR e i dati enzimatici non era certa, in quanto questi ultimi rivelano un danno conclamato. Tuttavia, \ue8 stata trovata una significativa correlazione (ANOVA, p<0.05) in soggetti a riposo, tra la produzione di ROS/TBARS e PC (rispettivamente: r2=0.74 e r2=0.60). Per rispondere allo scopo della ricerca, abbiamo assunto come modello l\u2019ipossia studiata 1) come situazione che induce uno sbilanciamento tra Stress Ossidativo e capacit\ue0 antiossidante e 2) nel tentativo di identificare i possibili meccanismi di ripristino dell\u2019equilibrio. Dall'insieme dei dati raccolti, al di l\ue0 dei risultati specifici, possiamo evincere che anche se la misura quantitativa assoluta della produzione di ROS (umol . mim-1) non pu\uf2 essere un parametro generalizzato, perch\ue9 funzione di variabili fisico-chimiche (pO2, Temperatura, concentrazione della sonda), acquisizione ed elaborazione dei parametri vanno comunque prese in considerazione. Dal calcolo dei limiti di detenzione (LOD): 30 \ub7 10-3 mM, e quantificazione (LOQ): 100 \ub7 10-3 mM, lo strumento si \ue8 rilevato sensibile e affidabile. Allo stesso tempo, va tenuto presente che il dato ottenuto rappresenta la produzione di ROS non tamponati dal sistema antiossidante. Per questo, si \ue8 ritenuto che la misura su campione ematico fosse rappresentativa della risposta sistemica integrativa. In particolare, il sangue capillare, oltre alla sua elevata sensibilit\ue0 e riproducibilit\ue0 (0,5% di differenza tra misure ripetute), ci ha permesso di disegnare un protocollo agile mini-invasivo. Da quanto fin qui esposto, possiamo ricavare che, al di l\ue0 della ricerca di un dato assoluto da riportare in letteratura, \ue8 una valida procedura che ogni soggetto, monitorato nel tempo risulti controllo di se stesso, ovvero che a indice della risposta equilibrio/squilibrio vengano quantizzate le variazioni. Nel tentativo di identificare i possibili meccanismi di ripristino dell\u2019equilibrio dello stress ossidativo, gli esperimenti sono stati condotti su: A) soggetti sani, che come tali sono caratterizzati da una condizione di equilibrio tra ROS e difese antiossidanti, B) soggetti affetti da patologie neurodegenerative, per i quali era logico attendersi, come confermato dalla realt\ue0, che fossero caratterizzati da una condizione di conclamato squilibrio, rivelabile da un significativo incremento di ROS prodotti in condizioni di riposo. In soggetti sani, si sono disegnati, messi a punto e applicati differenti protocolli sperimentali, per testare l\u2019effetto: a) dell\u2019esercizio fisico (stato ipossico transitorio) di breve (hockeisti e nuotatori) e lunga durata (atleti di triathlon); b) dell\u2019allenamento (nuotatori); c) dell\u2019ipossia normobarica e ipobarica acuta e prolungata (giovani soggetti sedentari); d) dell\u2019assunzione di molecole antiossidanti sulla produzione di ROS. In patologie neurodegenerative (pazienti affetti da: Neuropatia Diabetica (tipo II DN), decadimento cognitivo lieve (MCI) e Sclerosi Laterale Amiotrofica sporadica (sSLA)) dopo aver rilevato uno squilibrio in condizioni basali, \ue8 stato studiato l\u2019effetto dell\u2019esercizio/allenamento (SLA) o dell\u2019assunzione di antiossidanti (tipo II DN) sulla possibilit\ue0 di un potenziale ripristino a valori di equilibrio. Importanti risultati sono emersi dall\u2019analisi dei dati registrati nelle varie condizioni sperimentali e sono illustrati in questa tesi. ll tema comune di tutti i test, oltre all\u2019evidente studio sulla produzione dei ROS, \ue8 stato quello dell\u2019ipossia. Infatti l\u2019Ipossia, nelle sue varie espressioni (intese come deficienze parziali o totali di O2 nel nostro organismo), \ue8 stato elemento caratterizzante in tutti i protocolli che abbiamo testato. I protocolli di studio su pazienti sono tuttora in corso; pertanto i dati illustrati devono intendersi come preliminari. Nei soggetti patologici si \ue8 costatata una differente produzione di ROS in condizioni di riposo, mostrando un valore significativamente (p<0,05) pi\uf9 alto nei pazienti affetti da SLA (+20%) rispetto ai soggetti sani. L\u2019allenamento, in questi pazienti, sembra giocare un ruolo favorevole nel diminuire la produzione di ROS: un decremento del 7% \ue8 stato calcolato nei valori a riposo pre e post allenamento. Un sicuro effetto positivo dell\u2019allenamento controllato, dopo otto settimane, \ue8 stato osservato nei nuotatori (-25%) sulla produzione di ROS (2.24 \ub1 0.14 \u3bcmol \ub7 min-1). Tutti questi esperimenti sono stati condotti e i risultati ottenuti durante il secondo e terzo anno della mia Scuola di Dottorato. A parte gli specifici risultati ottenuti dal set di dati raccolti, osservazioni generali possono essere riassunte come segue: 1) Non vi \ue8 alcun modo per ottenere dati per quantificare il volume totale di ROS prodotta da un soggetto in qualsiasi condizione. Il dato EPR ricavato dalle misurazioni rappresenta l\u2019eccesso di ROS che il sistema ha prodotto (\u3bcmol \ub7 min-1) in una determinata condizione, ed \ue8 quindi un tasso di produzione di ROS Inoltre si \ue8 scelto di effettuare la misura da sangue invece che da campioni di tessuto in modo da ottenere dati il pi\uf9 possibile sistematici. In particolare, il sangue capillare (rispetto al sangue venoso o plasma) ha dato la possibilit\ue0 di sviluppare un metodo di misurazione affidabile, relativamente semplice e mini-invasivo. Tuttavia quando si passa da misurazioni di sangue capillare a venoso, bisogna prendere in considerazione la differente pO2. (la produzione di ROS in sangue venoso \ue8 stata trovata circa il 18% inferiore a quella nel sangue capillare: 1.79 \ub1 0.12 vs 1.48 \ub1 0.29 \u3bcmol\ub7min-1 rispettivamente). 2) I dati non possono essere presi come parametri generali, poich\ue9 dipendono strettamente da variabili fisico-chimiche (T, pO2) Da tutti questi punti, si pu\uf2 evincere che, al di l\ue0 della ricerca di un dato assoluto da riportare in letteratura, \ue8 una valida procedura che ogni soggetto, monitorato nel tempo risulti controllo di se stesso, ovvero che a indice della risposta equilibrio/squilibrio vengano quantizzate le variazioni. 3) Tuttavia si \ue8 consapevoli che il dato fornito da EPR deve essere integrato con dati sistemici quali: analisi ematochimiche di laboratorio (ematocrito, ferro, colesterolo, piastrine, neutrofili, linfociti, monociti), saturazione dell\u2019ossigeno, cinetica degli scambi gassosi (VO2max). Si ritiene che il metodo possa trovare applicazione i) medicina dello sport offrendo un valido aiuto nei centri sportivi per monitorare l\u2019efficacia dell\u2019allenamento e gli eventuali effetti dello stress provocato ed eventualmente migliorare i protocolli; ii) alla medicina di montagna per lo studio delle patologie da alta quota, poich\ue9 l\u2019ipossia \ue8 il primo e pi\uf9 delicato problema dell\u2019altitudine sin dalla quota media (1800m); iii) ai centri clinici/diagnostici per monitorare gli effetti delle terapie/trattamenti sulla progressione di patologia. Seconda parte della mia attivit\ue0 di ricerca, \ue8 stato lo studio in vitro dell\u2019ipossia da un punto di vista molecolare mediante misurazioni spettroscopiche EPR. Partendo da una visione molecolare, l\u2019ipossia orchestra una moltitudine di processi e di pathway molecolari. Nel tradizionale meccanismo dell\u2019ipossia si ha la presenza di una proteina eme in grado di rilevare il legame reversibile di O2 il quale causa un cambiamento allosterico nell\u2019emo-proteina: da inattivo (forma ossigenata) ad attivo (forma de-ossigenata). Quindi l'attivit\ue0 di una proteina emo \ue8 determinata dalla presenza o assenza dell\u2019ossigeno legato. Nella presente ricerca, la rilevanza di stati ipossici, dal punto di vista molecolare, atti ad essere rilevati sia in condizioni fisiologiche che patologiche \ue8 stato attribuito all\u2019Ossido Nitrico (NO) e al ruolo della Mioglobina (Mb). E\u2019 noto, infatti, che l\u2019NO \ue8 un radicale libero particolarmente espresso in condizioni ipossiche in quanto \ue8 in grado di regolare la vasodilatazione, quindi aumenta l\u2019afflusso di sangue e al tempo stesso pu\uf2 essere per\uf2 dannoso andando ad inibire la catena respiratoria a livello del complesso IV. In letteratura sono riportate cinque isoforme di Mb umana (Mb I-V) presenti nel muscolo scheletrico in percentuali diverse (Mb I: 75%; Mb II: 20%; Mb III-V: 5%) le cui funzioni non sono ancora state chiarite. Prendendo a riferimento Mb II, queste proteine differiscono solo per un singolo residuo aminoacidico: E54K (Mb I), K133N(Mb III), R139Q (Mb IV) a R139W (Mb V). Inoltre popolazioni tibetane, native dell\u2019alta quota, presentano come risposta all\u2019ipossia alte capacit\ue0 antiossidanti, alto flusso ematico sistemico, metabolismo ed efficienza meccanica migliore, alti livelli di metaboliti circolanti biologicamente attivi all\u2019NO e sono caratterizzate da un significativo aumento della concentrazione di Mb a livello muscolare con particolare riferimento all\u2019 isoforma 54E (Mb II). Il presente studio, grazie all\u2019analisi combinata EPR e simulazioni di Dinamica Molecolare (MD), contribuisce ulteriormente a sottolineare il ruolo importante svolto dalla Mb in condizioni di ipossia; inoltre segna un primo passo verso l'identificazione dei diversi ruoli svolti dalle isoforme della Mb Importanti risultati funzionali si sono ottenuti dallo studio EPR: l\u2019NO ha capacit\ue0 di legame significativamente maggiore con l\u2019isoforma 54E rispetto all\u2019isoforma 54K; questa \ue8 pi\uf9 circoscritta alla struttura dello stato de-ossigenato e la capacit\ue0 di legame diventa significativamente inferiore (p<0.01) e quasi identica per le due proteine in presenza di O2 anche a differenti livelli di pO2 (40 e 100 mmHg). Concludendo, osservazioni e prospettive future possono essere condensate nella convinzione, che confidiamo saranno condivise e verificate anche dal lettore, della validit\ue0 del nuovo del metodo sviluppato e dei dati raccolti. Alcuni risultati, in particolar modo quelli concernenti gli stati patologici, sono da considerarsi preliminari; tuttavia la strada da percorrere \ue8 estremamente interessante e richiede ulteriori indagini.The aim of the research developed in the time course of the three years of my Doctoral course in Molecular Medicine was to shed light into the mechanisms involved in Oxidative Stress responses in man at both integrative and molecular levels. To reach this general and high-level purpose we firstly focused our attention towards developing a method capable of returning an absolute quantitative estimation of Free Radicals production level. This particular aim was the subject of the first year of my researching activity. As a matter of fact, as is well known, in any physiological and/or pathological condition a subject could be involved, \u2018oxidative stress\u2019 results from the imbalance between Reactive Oxygen Species (ROS) production and his antioxidant capacity. Electron Paramagnetic Technique (EPR) resulted the method of choice since, as is well known, it is the only technique capable of returning, in a non-invasive way, the \u2018intrinsic\u2019 quantitative information (the signal is proportional to the number of excited electron spins). Indeed the beginning of my Doctoral period fortunately coincided with the acquisition by the Molecular Bioimaging and Physiology (IBFM) Institute of CNR (Lita Segrate) of an EPR instrument (e-scan Bruker BioSpin, Germany) of recent design, responding to the innovative characteristics of easy portability and handling. The spectrometer operates at the common X-Band microwave frequency and deals with very low concentration levels (nM) even in small sample volumes (50 \u3bcl). Aware of the novelty of the method, we first looked for a correlation between the attained EPR experimental data and those returned when adopting the classical enzymatic methods (e.g. ThioBarbituric Acid Reactive Substances (TBARS) and Protein Carbonyls (PC) data collected from the same subject). Indeed, a correlation could not, by principle, be expected, since, compared to the EPR data, enzymatic methods give a quantitative \u201ca posteriori\u201d evaluation of the damage produced by ROS, on lipids and cellular proteins. As a matter of fact, a positive correlation (ANOVA, p<0.05) was found between EPR ROS production data and TBARS (r2 ~ 0.7) as well as PC concentration (r2 ~ 0.6), which was found in resting subjects. Then, in order to achieve the overall objective of the research, we assumed \u2018hypoxia\u2019 as the \u2018particular\u2019 condition to be investigated, since it was viewed as a peculiar state capable of: 1) producing un imbalance between oxidative stress and anti-oxidant capacity; 2) offering the possibility of the identification of mechanisms involved in the perturbed balance restoring. To attain this \u2018secondary\u2019 aim, the experiments were carried out on: A) healthy subjects, that as such, were expected to start from a balance equilibrium condition; B) subjects affected by neurodegenerative pathologies, for whom, on the contrary, a sure imbalance condition was expected, that would be confirmed by a significant increment of ROS production, even at rest. However a fully innovative method had been developed, so that we lacked of referring literature data: a series of preliminary measurements on a homogeneous group of healthy subjects had to be firstly carried out, not only to optimize the acquisition and environmental conditions (T, pO2 that have to be carefully defined since they greatly affect EPR data), but also to reach reliable resting physiological values and range of variability. A great reproducibility of the data (\u3bcmol . min-1) was found on blood capillary samples taken from the same healthy subject six hours apart (r\ub2 = 0.99, ~ 0.5% discrepancy) and was calculated; limit of detection (LOD) and quantification (LOQ) of 30 19 10-3 mM and 100 19 10-3 mM were calculated respectively. In healthy subjects, the experimental protocols were designed in order to study the effects of: a) exercise (as inducing a transitory hypoxic state) of both short (in hockey players, swimmers) and long duration (in triathletes); b) training (as inducing a balance restore, in swimmers); c) hypoxia, both hypo- and normobaric (to study the effect of the assumed model condition itself, in young sedentary subjects); d) antioxidant molecules administration as an external way helping to restore the balance. In neurodegenerative pathologies (patients affected by: type II Diabetic Neuropathy (type II DN), Mild Cognitive Impairment (MCI) and sporadic Amyotrophic Lateral Sclerosis (sALS)) after checking the expected unbalance throughout a significant increase of ROS production (sALS versus healthy subjects: +20%, p