Sviluppo di un metodo in hlpc-ms per la quantificazione di proteine bioattive di lupino in miscele proteiche complesse

Una delle componenti nutraceutiche pi\uf9 interessanti del lupino \ue8 la conglutina-gamma, una proteina matura composta da una catena pesante e una leggera collegate da legami disolfuro, dotata di un\u2019interessante attivit\ue0 ipoglicemica1. Parallelamente questa proteina \ue8 considerata anche uno dei principali allergeni del lupino, anche in base ad alcune sue propriet\ue0 peculiari come la stabilit\ue0 termica e la resistenza alla proteolisi che sono considerate importanti caratteristiche comuni della maggior parte degli allergeni alimentari 2. La quantificazione delle proteine biologicamente attive negli alimenti \ue8 basata principalmente su saggi immunologici che hanno tuttavia alcuni limiti tecnici, come la cross-reattivit\ue0 con altre proteine alimentari e risultati falsi-positivi. In alternativa si stanno affermando metodi basati sulla spettrometria di massa3. Lo scopo del nostro lavoro \ue8 stato lo sviluppo di un metodo analitico \u201clabel-free\u201d per la quantificazione assoluta della conglutina-gamma, da utilizzare per la valutazione della qualit\ue0 nutraceutica di alimenti e ingredienti alimentari. Il metodo \ue8 basato sulla separazione degli idrolizzati triptici per mezzo della HPLC-Chip, una tecnica cromatografica che consente di ottenere separazioni particolarmente efficienti. L\u2019analisi quantitativa della proteina \ue8 stata effettuata in Multiple Reaction Monitoring (MRM), per avere una maggiore sensibilit\ue0 e selettivit\ue0 rispetto al metodo full scan. Per la quantificazione selettiva della conglutina-gamma sono stati selezionati cinque peptidi proteotipici, cio\ue8 specifici della proteina bersaglio. La quantificazione assoluta \ue8 stata condotta mediante l\u2019aggiunta standard di conglutina-gamma ad un grado elevato di purezza. L\u2019effetto matrice \ue8 stato ovviato mediante l\u2019aggiunta di quantit\ue0 note di una proteina esogena (nel nostro caso albumina di siero bovino, BSA) come standard interno. L\u2019elaborazione dei dati mediante l\u2019uso di sistemi informatici avanzati ha permesso di ottenere rette di taratura adeguate per una quantificazione assoluta ottimale in campioni incogniti. Riferimenti: 1. Magni C, Sessa F, Accardo E, et al. J Nutr Biochem 2004;15:646-50. 2. Breiteneder, H.; Mills, E.N.C. J. Allergy Clin. Immunol. 2005, 14-22 3. Carbonaro, M. Trends in Food & Technology 2004, 15, 209-21