Messa a punto di un metodo HPLC per la valutazione dell\u2019attivit\ue0 ACE-inibitoria di proteine vegetali

MESSA A PUNTO DI UN METODO HPLC PER LA VALUTAZIONE DELL\u2019ATTIVIT\uc0 ACE-INIBITORIA DI PROTEINE VEGETALI Giovanna Boschin,1 Elena Sirtori, 1 Graziana Scigliuolo, 2 Donatella Resta, 2 Anna Arnoldi1 1 Dipartimento di Endocrinologia, Fisiopatologia e Biologia Applicata, Laboratorio di Chimica degli Alimenti e Spettrometria di Massa, Universit\ue0 degli Studi di Milano, via Balzaretti 9, 20133 Milano. 2 HPF-Nutraceutics, via Balzaretti 9, 20133 Milano. Le patologie cardiovascolari rappresentano la prima causa di morte nei Paesi industrializzati. Per combattere tali patologie possono essere pianificate strategie preventive che tengono conto dei maggiori fattori di rischio, quali ipercolesterolemia e ipertensione. Questi fattori sono legati in parte allo stile di vita, comprese le abitudini alimentari, e possono quindi essere influenzati da opportuni interventi dietetici. Molti studi condotti negli ultimi anni si sono focalizzati sulla produzione e sull\u2019isolamento di peptidi ad azione antiipertensiva, partendo da differenti proteine vegetali e animali 1,2. Studi in vitro e in vivo hanno dimostrato come questi peptidi svolgano un\u2019azione diretta sull\u2019enzima di conversione dell\u2019angiotensina (ACE), l\u2019enzima chiave nella regolazione dei livelli pressori nell\u2019organismo umano. Essi si legano, infatti, a livello del sito attivo dell\u2019enzima e competono in modo diretto con l\u2019angiotensina I esplicando un\u2019azione inibitoria. I peptidi ACE-inibitori, come parte integrante di un alimento nutraceutico, hanno un interesse funzionale nel mantenimento di un buono stato di salute. Infatti, questi \u201cpeptidi funzionali\u201d non solo hanno un valore aggiunto nell\u2019alimento in cui sono presenti, ma esplicano anche un effetto fisiologico nell\u2019organismo umano 3. La valutazione dell\u2019attivit\ue0 ACE-inibitoria di peptidi potenzialmente bioattivi viene effettuata, principalmente, mediante tecniche spettrofotometriche basate sull\u2019utilizzo del tripeptide modello hippuryl-histidyl-leucina (HHL) 4. Essendo la tecnica spettrofotometrica affetta da problemi di bassa specificit\ue0 e sensibilit\ue0, \ue8 necessario sviluppare metodi pi\uf9 accurati per una determinazione quantitativa del grado di inibizione dell\u2019enzima ACE. Questo \ue8 soprattutto importante quando si testano peptidi o miscele peptidiche ottenute da fonti alimentari, che possono contenere degli interferenti. Scopo del lavoro \ue8 stato quindi quello di sviluppare un metodo in cromatografia liquida per la valutazione quantitativa dell\u2019attivit\ue0 ACE-inibitoria. Sono state inizialmente ottimizzate le diverse variabili del saggio quali tampone di reazione, tempo e temperatura della reazione enzimatica, concentrazione del substrato e dell\u2019enzima, che influenzano il saggio stesso. Quindi sono state messe a punto le condizioni cromatografiche dell\u2019analisi sia in HPLC con rivelatore DAD, sia in HPLC-Chip interfacciato con uno spettrometro di massa a trappola ionica. Il metodo \ue8 stato validato utilizzando molecole note per la loro attivit\ue0 ACE-inibitoria, in particolare i farmaci captopril, enalapril, lisinopril, e i tripeptidi IPP e VPP; in seguito sono state analizzate miscele peptidiche provenienti dalla digestione enzimatica di differenti proteine vegetali. 1. Vermeirssen V. et al. J Dairy Sci 2003, 86, 429-438. 2. Rotimi E. et al. J AOAC International 2008, 91, 947-956. 3. Fujita H., et al. J Food Sci 2000, 65, 564\u2013569. 4. Cushman D. W. & Cheung H. S. Bio Pharm 1971, 20, 1637-1648