Sviluppo e convalida di una metodologia in chemiluminescenza per la determinazione di N-nitroso-ammine in preparati eparinici di natura semisintetica

L\u2019analisi in chemiluminescenza, metodologia ad elevata sensibilit\ue0, \ue8 stata da noi ampiamente utilizzata per la determinazione del rilascio di ossido d\u2019azoto (NO) da parte di farmaci NO-donor; con questa metodologia \ue8 infatti possibile determinare la presenza di nitrati, nitriti e di nitrosotioli, forme di metabolismo e di trasporto dell\u2019NO, nei liquidi biologici e tessuti (1-2). Sulla base di queste potenzialit\ue0, la ricerca ha avuto come oggetto la messa a punto di una metodologia per la determinazione di N-nitroso addotti (RN-NO) in preparati eparinici di natura semisintetica (nadroparine), che si formano in seguito a demolizione di eparine ad elevato peso molecolare per trattamento con acido nitroso. Il metodo si basa sulla determinazione chemiluminometrica dell\u2019NO rilasciato dalle N-nitrosoammine (standard N-nitroso-dimetilammina, NDMA) per reazione con CH3COOH e HBr; le analisi sono state effettuate con un Chemiluminometro Nitric Oxide Analyzer Model 280 (NOA) munito di camera di campionamento per liquidi e software NOAnalysis (Sievers). Il metodo \ue8 stato convalidato in termini di specificit\ue0, linearit\ue0, limite di rilevamento (LOD), limite di quantizzazione (LOQ), precisione e accuratezza. Per quanto riguarda la specificit\ue0, le principali interferenze sono dovute agli ioni nitrito che vengono comunemente determinati per via chemiluminometrica attraverso un metodo di riduzione selettiva che utilizza la coppia CH3COOH glaciale e KI. Per poter effettuare l\u2019analisi di N-nitrosammine anche in presenza di elevate concentrazioni di ioni nitrito, \ue8 stata utilizzata una procedura che prevede la preventiva addizione al campione di eparina (solubilizzato in acqua) di sulfanilammide (soluzione allo 0.5% in HCl 1N). La concentrazione di RN-NO \ue8 stata determinata su una serie di curve di calibrazione (n = 5) preparate solubilizzando la NDMA in acqua (intervallo di concentrazioni compreso tra 0.074 e 11.1 mg/ml; 1 - 150 \ub5M) e iniettando aliquote da 10 microl, corrispondenti ad un intervallo, espresso in pmoli di NO iniettate, compreso tra 10 e 1500. La risposta strumentale (mV) \ue8 lineare nell\u2019intero intervallo di calibrazione, con coefficiente di correlazione di 0.9998 ed equazione della retta y = 5.720 (\ub1 0.00486) x \u2013 9.561 (\ub1 2.825), dove x = pmoli NO. Il limite di rilevamento (LOD) \ue8 risultato essere 0.074 mg/ml di NDMA, corrispondente a 740 pg iniettati e a 10 pmoli di NO iniettate, mentre il limite di quantizzazione (LOQ) \ue8 risultato essere 0.21 mg/ml di NDMA, corrispondente a 210 pg iniettati e a 28.3 pmoli di NO iniettate. La precisione e accuratezza del metodo sono state determinate per analisi replicate (n = 5) di soluzioni di NDMA a 5 livelli di concentrazione nell\u2019intervallo di calibrazione (30, 62.5, 125, 375 e 1000 pmoli NO iniettate). I dati relativi a precisione e accuratezza intra- e inter-day indicano che il metodo \ue8 sufficientemente accurato e preciso, con valori di RE% compresi tra \u2013 1.78% e + 12.30% della concentrazione nominale, e valori di CV% compresi tra 0.84% e 4.83% nell\u2019ambito dell\u2019intervallo di concentrazioni considerato. Questo ha reso possibile determinare le specie RN-NO a livelli molto inferiori, almeno di un ordine di grandezza, rispetto al limite consentito (250 ng/g) dalla Farmacopea Europea. Il metodo, applicato all\u2019analisi di 20 campioni di nadroparine, ha indicato un\u2019ampia variabilit\ue0 nel contenuto di RN-NO in relazione al metodo di preparazione