Avaliação da capacidade de degradação de microcistinas por bactérias heterotróficas presentes no meio aquático

Dissertação de mestrado em Microbiologia Aplicada, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2018.This thesis was fully performed at Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge under the direct supervision of Elisabete Maria Pinto Valério in the scope of the Master in Applied Microbiology of the Faculty of Sciences Of the University of Lisbon.Microcystins (MC) are the hepatotoxins produced by cyanobacteria, which are photosynthetic organisms that usually colonize aquatic environments. Climate change has had a significant impact on the increased frequency of cyanobacterial blooms, which are often associated with the production of cyanotoxins. Studies show that the growth of aquatic heterotrophic bacteria that co-occur with cyanobacteria may not be affected by the presence of MC, or, on the other hand they may present a reduction in growth, never being totally inhibited by their presence (Miguéns, 2013; Pinto, 2016). The aim of this study was to examine the effects of three microcystin variants (MCLR, MCRR, MCYR) on heterotrophic aquatic bacteria living in the same ecosystem as cyanobacteria. In particular, (1) to observe the impact of microcystins on the growth of heterotrophic bacteria, (2) the impact on the enzymes of the antioxidant system of these bacteria and (3) to screen the presence of mlr genes. For this purpose, we performed the morphological and molecular characterization of 22 bacteria isolated from two reservoirs. It was intended to analyze the growth of bacterial isolates exposed to different concentrations of extract of each variant of MCs, and also to two concentrations of pure microcystin-LR. The search for the presence of MCs degradation genes (mlrA-D), was done using PCR. In order to analyze the effect of microcystins on the antioxidant system of the isolates, catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD1 and SOD2) activities were determined spectrophotometrically, at 240 nm and 550 nm, respectively, in the cells exposed to the different variants of microcystin. None of the isolates grown in liquid medium was completely inhibited by the exposure to microcystins, however, it was found that MCs can reduce the growth of most bacteria tested. While some bacteria grew without any induced effect, others reacted differently according to the variant and the concentration (in the same isolate). In some cases a slight growth stimulation was observed. In most cases the growth stimulation appears to be related with other molecules from the MC extracts. The results of the determination of CAT and SOD activities revealed that only three isolates have catalase, namely M17F, M17K and 594196, and only three isolates have superoxide dismutase, M17C, M17D and 594196. In this study, a heterotrophic bacteria, M17C, mlr+, was also isolated, mlr genes were amplified and sequenced. A new primer pair for the mlrA was also proposed in this study. In summary, the results from this study, showed that there is not a pattern characteristic of the species or genera analyzed, thus indicating that the response of the heterotrophic bacteria isolates to MCs is mainly related to strain characteristics. They corroborate previous studies, which indicate that the cluster of mlr genes is not the only cause to allow bacteria to grow in the presence of MC without being affected by them, even with no alteration in the main enzymes from the antioxidant system (CAT and SOD).As cianobactérias são organismos fotossintéticos capazes de colonizar uma grande variedade de habitats, em que se destacam os ambientes aquáticos. Nestes ambientes aquáticos as cianobactérias habitam a zona fótica, que corresponde à camada superficial da água que recebe luz solar. Em ambientes hídricos eutrofizados e em condições ambientais favoráveis, como temperaturas elevadas e grande disponibilidade de nutrientes como fosfatos e nitratos, as cianobactérias podem atingir elevadas densidades celulares, um fenómeno conhecido por blooms ou florescências. As alterações climáticas têm tido um impacto significativo no aumento de frequência de blooms de cianobactérias. Estes blooms podem levar a um decréscimo de oxigénio e à produção de toxinas por cianobactérias (metabolitos secundários, normalmente designados cianotoxinas). Hoje sabe-se que, até 70% dos blooms de cianobactérias são tóxicos (Kazuya et al, 2011). O efeito das cianotoxinas é já bem conhecido em mamíferos, permitindo uma divisão das cianotoxinas pelo seu alvo principal, nomeadamente: (1) neurotoxinas, cujo principal alvo é o sistema nervoso, (2) dermatotoxinas, de que o principal alvo é a pele e (3) hepatotoxinas, em que o fígado é o alvo principal (Zanchett et al, 2013). As microcistinas (MCs) são o tipo de hepatotoxinas mais produzidas por cianobactérias, sendo a microcistina-LR, microcistina-RR e microcistina-YR as variantes mais comuns destas toxinas. Os efeitos tóxicos destas cianotoxinas encontram-se amplamente estudados em organismos eucariotas, contudo os efeitos em microrganismos são ainda escassos. As cianobactérias encontradas em ambientes aquáticos convivem com outros microrganismos, nomeadamente bactérias heterotróficas como Aeromonas spp. e Flavobacterium spp. Nos últimos anos, tem-se procurado perceber de que forma é que bactérias heterotróficas, existentes em águas superficiais onde ocorrem habitualmente blooms de cianobactérias se comportam perante a presença de MCs. Verificou-se que estas toxinas, em alguns casos não têm qualquer efeito no crescimento das bactérias, enquanto que noutros provocam uma diminuição do crescimento de vários isolados de espécies diferentes, não o inibindo totalmente (Miguéns, 2013). Estes estudos levaram à descoberta de bactérias heterotróficas aquáticas degradadoras de MCs. A primeira via de degradação de MCs foi descoberta por Bourne et al (2001) em bactérias do género Sphingomonas. Mais tarde, Bourne et al (2001), percebeu que o cluster de genes envolvido nesta via de degradação era composto por quatro genes, mlrA, mlrB mlrC e mlrD. Novos isolados de outras espécies foram identificados como detentores do cluster mlr. No entanto, o número de bactérias mlr+ tem-se mostrado reduzido. Mais recentemente bactérias heterotróficas aquáticas degradadoras de MCs, mlr-, foram detetadas (Manage et al, 2009) e o seu estudo parece indicar que, apesar de serem menos eficientes na degradação de MCs do que as bactérias mlr+, estas estão presentes em maior número. Em 2016, Lezcano et al, propôs que a degradação de MCs por bactérias mlr- poderá estar associada ao metabolismo xenobiótico, ideia que veio reforçar a observação feita por Kormas e Lymperopoulou (2013) segundo a qual a maioria das bactérias degradadoras de MCs consegue normalmente “biodegradar” outros produtos. Em 2017, Dziga et al propôs a primeira via de degradação de MCs mlr-, que se pensa envolver um consórcio de bactérias heterotróficas aquáticas. Não estão ainda descritos os genes associados, apenas os locais de corte da MCs são para já conhecidos. Estudos mostram que a exposição de bactérias heterotróficas aquáticas a MCs induz, entre outros efeitos, stresse oxidativo (Li et al, 2009), induzindo a formação de espécies reativas de oxigénio (ROS), como resultado do metabolismo oxidativo (Pflugmatcher, 2004). Os ROS podem causar sérios danos nas células, como a peroxidação de membranas lipídicas, genotoxicidade, apoptose e necrose (Ding e Ong, 2003). O objetivo deste estudo foi examinar os efeitos de três variantes de MCs (MCLR, MCRR, MCYR) em bactérias heterotróficas aquáticas que vivem no mesmo ecossistema que as cianobactérias. Nomeadamente (1) observar o impacto das MCs no crescimento das bactérias heterotróficas, (2) o impacto destas nas enzimas do sistema antioxidante das bactérias e (3) rastrear a presença de genes mlr. Para tal, procedeu-se à caracterização morfológica e molecular das bactérias isoladas. Pretendeu-se analisar o crescimento de isolados bacterianos expostos a diferentes concentrações de extrato de cada variante de MCs, e ainda a duas concentrações de microcistina-LR pura. Pesquisou-se a presença de genes de degradação de MCs (mlrA-D), recorrendo a PCR e confirmando quais os produtos amplificados por sequenciação. Analisou-se o efeito das MCs no sistema antioxidante dos isolados, nomeadamente, a atividade enzimática da catalase (CAT) e da superóxido dismutase (SOD) sendo estas determinadas espectrofotometricamente a 240 nm e 550 nm, respetivamente, nas células expostas às variantes da MCs. Neste estudo, das 22 bactérias isoladas das Albufeiras de Magos e Roxo, oito são Aeromonas spp. e cinco são Flavobacterium spp. Nenhum dos isolados que cresceu em meio líquido foi totalmente inibido pela exposição a MCs, no entanto, verificou-se que as MCs podem reduzir o crescimento da maioria das bactérias testadas, sendo que algumas bactérias cresceram sem efeito algum induzido, enquanto outras reagiram de forma diferente consoante a variante e a concentração usada no mesmo isolado. Em alguns casos observou-se ainda uma ligeira estimulação do crescimento. A comparação de respostas a extratos de MCLR e MCLR pura parece indicar que outras moléculas presentes no extrato estão a influenciar o crescimento das bactérias heterotróficas. Por exemplo, na maioria dos casos em que houve uma aparente estimulação do crescimento do isolado causado pela MC, correspondeu à adição de extratos, verificando-se que a mesma estimulação não ocorria quando era adicionada microcistina pura ao meio. Os resultados da determinação das atividades da catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD) revelaram que apenas três isolados têm catalase, nomeadamente, M17F, M17K e 594196, e apenas três isolados têm superóxido dismutase, M17C, M17D e 594196. Juntando estes resultados aos resultados anteriores (Miguéns, 2013 e Pinto, 2016) algumas conclusões foram possíveis. Em relação à catalase, (1) a maioria das bactérias estudadas não apresentam atividade CAT nestes três estudos (19 isolados foram testados e apenas em seis foi detetada atividade deste enzima). (2) A maioria dos isolados apresentou redução de atividade quando expostos ao extrato de MCLR e a maioria dos isolados apresentou aumento de atividade CAT quando expostos ao extrato de MCRR, podendo esta resposta ser causada pela diferente hidrofobicidade das variantes MC (sendo MCLR mais hidrofóbica que a MCRR) o que vai facilitar a sua entrada na célula causando assim mais dano. (3) Sphingomonas sp. isolado 594196, também parece ter uma resposta completamente diferente à exposição de variantes de MCs, em comparação com os outros isolados. Em relação à atividade SOD, (1) os resultados suportam a ideia de que a resposta da atividade SOD às MCs é uma característica de estirpe. (2) Outros mecanismos podem estar envolvidos na degradação de O2●-. Neste estudo foi ainda isolada uma bactéria heterotrófica mlr+, denominada M17C, cujos quatro genes mlr foram sequenciados. Um novo par de primers mlrA foi ainda proposto neste estudo. Em resumo, os resultados apontam para que a resposta dos isolados às MCs esteja relacionada com as características de cada estirpe e corrobora estudos anteriores que indicam que o cluster de genes mlr não é a única via que permite que bactérias cresçam na presença de MC sem serem afetadas por estas, mesmo quando não há resposta alterada nas principais enzimas do sistema antioxidante. Conclui-se ainda que outros componentes do extrato de MC podem estar a afetar as bactérias de diferentes maneiras, interferindo nos ensaios.