Biomedical applications of Surface Enhanced Raman Spectroscopy - a step forward to clinical practice

openLo scopo di questo progetto di dottorato è quello di utilizzare delle superfici metalliche nanostrutturate come substrati per la spettroscopia Raman amplificata da superfici (SERS) per l’analisi di biofluidi. Questa tecnica analitica restituisce l’impronta digitale vibrazionale del campione grazie alla presenza della nanostruttura metallica. Queste caratteristiche anticipano le potenzialità della spettroscopia SERS in campo bioanalitico che ha visto un aumento esponenziale delle sue applicazioni nell’ultimo decennio. In particolare, la SERS richiede la fabbricazione di substrati metallici nanostrutturati che possano funzionare da sensori. Questo progetto si basa sullo sviluppo di un approccio privo di marcatura (label-free:): nessuna funzionalizzazione è presente sulla superficie metallica al fine di rilevare in modo aspecifico gli analiti presenti della matrice di interesse biologico. Il risultato del segnale SERS sarà un’istantanea della soluzione in analisi depositata sulla superficie metallica, cioè l’impronta specifica del campione. Per esempio, l’analisi label-free dei biofluidi riflette il suo contenuto metabolico. Nell’era “omica”, il SERS può essere integrato nella metabolomica non funzionalizzata in quanto fornisce il profilo metabolico del soggetto in esame e di conseguenza distinguere campioni diversi basandosi sulle differenze di ogni profilo analizzato. I colloidi stabilizzati elettrostaticamente sono stati scelti per la loro nota compatibilità con i biofluidi. Verranno usati sia in forma colloidale in sospensione acquosa, sia fissati su un supporto di carta, definiti supporti solidi e sviluppati grazie a un protocollo validato nel nostro laboratorio. Il vantaggio portato dai supporti in carta risiede nella stabilità della risposta spettroscopica: sono di lunga durata, facili da fabbricare e da maneggiare, economici e veloci, potenzialmente fabbricabili su ampia scala. Queste sono le caratteristiche che nell’ambito delle applicazioni del SERS possono promuovere la costruzione di un dispositivo Point of Care. Basandosi sulle competenze acquisite dal nostro gruppo di ricerca, lo scopo di questa tesi di dottorato è duplice: aumentare le nostre conoscenze sull’interazione biofluidi-nanostrutture e utilizzare il metodo SERS per lo studio di specifici problemi clinici. Al fine di soddisfare tali richieste questo lavoro è diviso in tre parti: 1. Sviluppare protocolli per l’analisi label-free delle frazioni di sangue (siero, plasma, eritrociti, cellule mononucleate del sangue periferico, e sangue intero) con il SERS, sfruttando le loro caratteristiche in base alla diversa preparazione dei campioni e ai substrati SERS utilizzati; 2. Caratterizzare il comportamento delle biomolecole sulla superficie di nanoparticelle metalliche su sistemi modello, cioè capire il ruolo delle corone di proteine e non proteine nell’interazione metabolita-nanoparticelle. Il sistema modello usato si basa su un insieme di albumina di siero umano (la più abbondante proteina del siero) e molecole che sono comunemente osservate nei biofluidi: adenina, ipoxantina e acido urico; 3. Applicare le nozioni di cui sopra per la diagnosi precoce di diverse malattie (tumore al seno, fegato grasso non alcolico, cirrosi e carcinoma epatocellulare) tramite campioni di sangue e plasma e l’uso di analisi dati multivariata per spettri SERS. Lo scopo dell’utilizzo del SERS in ambito medico è di proporre nuovi approcci diagnostici complementari alle tecniche già in uso in clinica come ad esempio i metodi di immunochimica e istopatologia. Il vantaggio del SERS risiede nella rapida risposta e in un approccio non invasivo tramite l’utilizzo di biopsia liquida. Lo scopo futuro è lo sviluppo di una piattaforma SERS label-free come dispositivo point of care integrato allo strumento RamanThis PhD project aims to apply nanostructured metal surfaces as substrates for Surface Enhanced Raman Spectroscopy for the study of biofluids. This analytical technique provides the vibrational fingerprint of a sample assisted by nanostructured metal surfaces, which can enhance the scattering signal of analytes adsorbed on them: this allows detection of analytes in very low concentrations. These features tell a lot about the potential of SERS in the bioanalytics, and indeed, in this field, the use of SERS has increased over the past decade taking advantage of both sensitive detection and fingerprinting features. Above all, SERS requires the manufacturing of metal nanostructured substrates as sensors. In particular, this project is based on the development of a label-free approach: no functionalization is present on the nanoparticles surface, and, hence, no preferential affinity for a given analyte in the biological matrix is sought. Briefly, once nanoparticles are in contact with the specimen, the analytes may adsorb on them without any specific interaction other than their affinity for the metal. The outcoming SERS signal will be a snapshot of what actually reached the metal surface, namely a fingerprint of the sample. For instance, the label-free analysis of biofluids reflect the metabolic content of the fluid itself. In the “omic” era, SERS can integrate with untargeted metabolomics and provide the metabolic profile of a specimen and distinguish different samples accordingly, based on differences in such profiles. Silver colloids have been chosen, given that their performances with biofluids are known. They have been used both as colloidal suspension in water, and fixed on a paper support, according to an in-house developed protocol for the fabrication of solid substrates. The coupling of metal nanostructures substrates with SERS acts as actual sensors, able to interact with aqueous environment and detect dissolved analytes. The real advantage of the paper supports lay in the stability of the spectroscopic response: they are long lasting, easy to fabricate and to handle, cost and time effective, prone to scale up. These reasons make them potential Point of Care tool in the frame of SERS applications. The aim of this PhD thesis is twofold: to push forward our fundamental knowledge of the nanostructure-biofluid interaction and to test the feasibility of the application of SERS for specific clinical problems. These goals were pursued in three steps: 1. to develop protocols for the label-free analysis of blood fractions (serum, plasma, erythrocytes, periphereal blood mononuclear cells, and whole blood) with SERS, exploiting their features according to several treatments and SERS substrates; 2. to characterize the behaviour of biomolecules at the interface with metal nanoparticles on model systems, namely to understand the role of the protein and non-protein corona in the metabolites-nanoparticle interaction. The model system used is based on mixture of human serum albumin (i.e. the most abundant serum protein) and molecules which are commonly detected in SERS of biofluids: adenine, hypoxanthine and uric acid; 3. to apply the aforementioned knowledge to the early diagnosis of several diseases (breast cancer, non-alcoholic fatty liver diseases, cirrhosis and hepatocellular carcinoma) through serum and plasma samples by means of multivariate data analysis of SERS spectra. Considering the latter application of SERS in the field of disease diagnosis, the aim is to provide new diagnostic methods complementary to the accepted gold standards such as immunochemistry and histopathology methods. The advantages of SERS lay on the rapid response and on the non-invasiveness of the liquid biopsy approach. As a future goal, the development of SERS platforms as label-free point of care tools integrated to portable Raman instruments could bring the diagnosisNANOTECNOLOGIEembargoed_20200221Gurian, Elis