Estrategias reproductivas de moluscos gasterópodos : Caracterización bioquímica y toxicidad de los huevos de Pomacea maculata (Caenogastropoda: Ampullariidae)

Pomacea maculata (Gastropoda: Ampullariidae) es un caracol dulceacuícola nativo de Sudamérica que ha sido introducido en el sudeste asiático, Europa e islas del Océano Pacífico donde se ha convertido en una seria plaga para la agricultura, principalmente en cultivos de arroz y taro. Estos organismos representan también un riesgo sanitario importante como hospedadores intermediarios de varios parásitos, como el nematode Angiostrongylus cantonensis, agente causal de una meningoencefalitis eosinofílica humana. Su introducción en nuevas áreas también ha generado un gran impacto ecológico en los sistemas acuáticos invadidos. Además de la demanda de conocimiento en busca de soluciones para los problemas antes mencionados, otras características llamativas de los ampuláridos han despertado el interés para la investigación de su biología. En particular, su inusual modo de vida anfibio despierta interrogantes acerca del origen de novedosas adaptaciones anatómicas y comportamentales, en ocasiones únicas, como la presencia de un doble sistema respiratorio y la estrategia reproductiva de oviposición aérea. Así, en el proceso de oviposición, las hembras del género Pomacea, depositan sus huevos fuera del agua en masas calcáreas que quedan expuestas a las condiciones severas del ambiente aéreo como la elevada radiación solar y la temperatura, la desecación y los depredadores terrestres. A pesar de ello, sus embriones se desarrollan y eclosionan normalmente. Este hecho llevó a suponer la existencia en el huevo de algún sistema de protección efectivo contra los factores ambientales antes mencionados que además logra disuadir a los potenciales depredadores. Apoyando esta hipótesis, y contrariamente a lo esperable, se han registrado muy pocos casos de depredación en condiciones naturales. De hecho, esta estrategia reproductiva inusual dentro de los ampuláridos, ha sido considerada una característica clave para el éxito evolutivo del género Pomacea, el clado más especioso y más ampliamente distribuido de los ampuláridos. En los ampuláridos, como en la mayor parte de los gasterópodos, el vitelo tiene escaso desarrollo y en su lugar, el embrión está rodeado de un fluido perivitelino (FPV), que constituye la principal fuente nutricia para el embrión. Además, el FPV de Pomacea, tiene funciones de protección contra los factores bióticos y abióticos arriba mencionados. En particular varias de sus proteínas (perivitelinas) han mostrado propiedades fotoprotectoras, antioxidantes, antinutritivas (no digeribles), antidigestivas (inhibición de la digestión) y neurotóxicas; asimismo proveen al huevo de una coloración muy llamativa, considerada de advertencia (aposemática). Así, las perivitelinas conforman un sistema de defensa efectivo que explicaría la viabilidad de los huevos en el hostil ambiente aéreo. La inmensa mayoría de los estudios arriba mencionados, han sido realizados en la especie P. canaliculata desconociéndose la composición y propiedades de los huevos de otros ampuláridos. Contar con esta información permitiría establecer comparaciones evolutivas sobre el rol de los mecanismos defensivos en la estrategia reproductiva, y ayudaría a comprender la importancia de la oviposición aérea en la diversificación y dispersión del género Pomacea. En este contexto, el objetivo general del presente trabajo de Tesis Doctoral es contribuir al entendimiento de la biología reproductiva de los moluscos gasterópodos del género Pomacea, aportando al conocimiento acerca de los mecanismos de defensa de los huevos de la especie P. maculata. En particular se pretende obtener información detallada de los componentes de los huevos de esta especie y de la presencia de las defensas bioquímicas que han sido encontradas en otros ampuláridos, o bien de nuevos mecanismos defensivos. Asimismo, se pretende caracterizar estructural y funcionalmente a la PmPV2, la perivitelina ortóloga a la neurotoxina de P. canaliculata (PcPV2), así como estudiar su mecanismo de acción e interacción con membranas, evaluar su capacidad para ingresar a un potencial depredador, y determinar su capacidad enterotóxica. En primer lugar, analizamos los huevos de P. maculata estudiando su composición general, toxicidad, su actividad hemaglutinante, y sus propiedades antinutritivas y antidigestivas. Observamos que están compuestos mayormente por polisacáridos y proteínas (perivitelinas), seguidos por cantidades menores de lípidos y calcio no soluble. El polisacárido de reserva identificado fue el galactógeno, un polisacárido exclusivo de la reproducción de la mayoría de los gasterópodos. Dos perivitelinas denominadas PmPV1 y PmPV2, se acumulan masivamente y representan el ~85 % de la masa seca de las proteínas totales. Los lípidos más abundantes corresponden a fosfolípidos y colesterol. Entre los compuestos inorgánicos, el calcio fue el ión más abundante, relacionado con la presencia de una cubierta calcárea que rodea y protege a los huevos de esta especie. Se identificaron una gran variedad de potenciales defensas contra factores bióticos particularmente una potente actividad tóxica, actividades antidigestivas y antinutritivas y una moderada actividad lectina. La inyección i.p. en ratones del FPV de esta especie generó síntomas neurológicos semejantes a los reportados para la PcPV2 de P. canaliculata, sugiriendo la presencia de una toxina semejante. Se determinó también la presencia de inhibidores de proteasas que podrían actuar como un sistema de defensa tanto contra patógenos como contra depredadores (antidigestión). Notoriamente, demostramos que el galactógeno es refractario a la digestión in vitro por glicosidasas digestivas, siendo esta la primer evidencia de un polisacárido de reserva con una posible función de defensa antinutritiva. En conclusión, hemos caracterizado detalladamente el ~99 % de la composición de los huevos y hemos identificado múltiples defensas potenciales, provistas no sólo por las proteínas sino que también por el galactógeno. Presentamos la primer evidencia, según nuestro conocimiento, de que los azúcares de reserva pueden estar involucrados en defensas anti-depredación, y esto brindaría la primer explicación de su amplia distribución en los huevos de gasterópodos, aportando asimismo nueva información sobre la estrategia reproductiva inusual de Pomacea. En segundo lugar, demostramos que la actividad tóxica de los huevos de P. maculata es debida a una proteína de c.a. 400 kDa, la PmPV2, que es ortóloga a la PcPV2 de P. canaliculata. Demostramos parte de su mecanismo de acción, observando que esta proteína multimérica forma poros con forma de anillo en las células intestinales, alterando la permeabilidad de su membrana y llevando a una muerte celular rápida. La PmPV2 es, por tanto, un miembro de las toxinas formadoras de poros (PFT). Combina dos proteínas ancestrales del sistema inmune: una lectina con estructura de β-propeller unida por puente disulfuro a una proteína de la superfamilia de las citolisinas dependientes de colesterol - proteínas del complejo de ataque a membrana/perforina (CDC/MACPF). Esta estructura dimérica recuerda a las “toxinas-AB” descriptas en bacterias y plantas, mientras que en animales sólo se había descripto en los huevos de P. canaliculata (toxina PcPV2). En este trabajo observamos que el dominio MACPF se encuentra fusionado con un novedoso dominio accesorio, presente exclusivamente en los invertebrados, que podría intervenir en la unión de la toxina a la membrana de la célula blanco, al que denominamos IMAD. Estudiamos luego la interacción de la PmPV2 con membranas y observamos que se une a un receptor glicoproteico mediante la subunidad lectina (módulo “B” de delivery) e interacciona fuertemente con el colesterol de la bicapa lipídica para penetrar la membrana plasmática por medio de la subunidad MACPF (módulo “A” tóxico). Más aún, demostramos que la unión del módulo B es necesaria para la acción citotóxica de la PmPV2. Los resultados obtenidos en esta parte del presente trabajo de Tesis Doctoral ubican a las PV2s como las primeras PFT descriptas en moluscos y las únicas PFT acumuladas dentro de huevos reportadas hasta la fecha. Se brindan asimismo las primeras evidencias acerca del mecanismo de reconocimiento de membrana y formación de un poro para una PFT de toda la familia MACPF. Finalmente, analizamos la capacidad de la toxina PmPV2 de resistir la digestión gastrointestinal, su interacción con el sistema digestivo y su capacidad de generar una respuesta inmune adaptativa, utilizando ratones como animales modelo. Observamos que la PmPV2 tolera el paso por el sistema gastrointestinal y llega al intestino de forma activa. Demostramos que luego se une a los enterocitos modificando la morfología intestinal para finalmente disminuir la superficie absortiva de su mucosa en menos de 48 h. Observamos también que la PmPV2 es citotóxica para las células intestinales, y altera la permeabilidad de una monocapa de estas células, estableciendo una posible vía de entrada a través del epitelio. Marcando la toxina fluorescentemente vimos que es captada in vivo por las células de las placas de Peyer del intestino delgado, indicando otra nueva vía de ingreso al sistema. Independientemente del camino que sigue la PmPV2 para atravesar la barrera intestinal, observamos que la administración oral de esta toxina genera una respuesta inmune adaptativa en ratones produciendo anticuerpos IgG detectados en circulación y capaz de neutralizar el efecto neurotóxico de la misma. Los resultados de esta parte del trabajo de Tesis brindan la primera evidencia de la/s forma de ingreso a un depredador y sobre todo de que la PmPV2, además de ser una neurotoxina, presentaría una importante actividad enterotóxica, pudiendo ser ésta una de las causas del comportamiento de evasión por parte de los depredadores. En conjunto, los resultados del presente trabajo de Tesis Doctoral indican que los huevos de P. maculata presentan un sistema de defensa bioquímico complejo para repeler a un potencial depredador, integrando diversos mecanismos defensivos mediante proteínas y azúcares que a la vez sirven de nutrientes para el embrión en desarrollo. Este efectivo sistema defensivo de las especies de Pomacea permitiría explicar la escasez de depredadores de sus huevos. Finalmente, cabe destacar que el descubrimiento de mecanismos de acción novedosos en moléculas bioactivas aumenta el acervo de herramientas potencialmente aplicables en biotecnología y biomedicina.Facultad de Ciencias Naturales y Muse