Interaction of phages with biofilms of single and mixed multidrug resistant species involved in pneumonia infections

Dissertação de mestrado em BiotechnologyPseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii are two Gram-negative pathogens frequently involved in hospital infections, including pneumonia or cystic fibrosis. Most infections caused by these bacteria are difficult to treat because of their low susceptibility to antibiotics, which is often associated with their ability to adhere to surfaces and form biofilms. Therefore, the World Health Organization has classified these microorganisms as top priority bacteria that urgently require the development of novel therapeutic approaches. Bacteriophages (phages) are bacterial viruses that have emerged as a possible novel treatment against antibiotic-resistant infections. The aim of this work was to study phage interaction with biofilms of P. aeruginosa PAO1 and A. baumannii RUH 134. To achieve this goal, single- and dual-species bacterial biofilms were characterized, revealing that both bacteria were able to form thick biofilms although depending on the culture media used. Interestingly, growth of these bacteria in dual-species biofilms led to the complete eradication of A. baumannii by P. aeruginosa in just 48h. After biofilm characterization, the efficacy of phages against single species biofilms with 24h, 72h and 7 days was evaluated. Although a significant reduction in viable cells and total biomass was observed in the first 3h and 6h post-infection of 24h- and 72h-old biofilms for both bacteria, after 24h of treatment the emergence of phage-resistance variants was observed. It was further observed that older biofilms (7 days) were in general less susceptible to phage treatment unless biofilms were cultured on DMEM:F12. The efficacy of phages was also evaluated against bacteria colonizing the normal human airway epithelial cell line NuLi-1. Phage treatment of NuLi-1 epithelial cells colonized with each bacterial species resulted in a significantly reduced mammalian cell death, with an effect that lasted longer than the activity of the phage on the bacterial cells. In conclusion, both phages revealed to be non-toxic for mammalian cells and a valuable approach for both early biofilm treatment and control of bacteria adhered to human epithelium.Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii são duas bactérias Gram-negativas patogénicas que estão frequentemente associadas a infeções hospitalares, incluindo pneumonia e fibrose cística. A maioria das infeções causadas por estas bactérias são difíceis de tratar devido à sua baixa suscetibilidade aos antibióticos, que está frequentemente associada com a sua capacidade de aderir a superfícies e formar biofilmes. Assim, a Organização Mundial de Saúde classificou estes microrganismos como bactérias de prioridade máxima que requerem o desenvolvimento urgente de novas abordagens terapêuticas. Bacteriófagos (fagos) são vírus bacterianos que têm emergido como uma potencial estratégia no tratamento de infeções resistentes a antibióticos. O objetivo deste trabalho foi o estudo da interação entre fagos e biofilmes de P. aeruginosa PAO1 e A. baumannii RUH 134. Para isso, foi avaliada a formação de biofilme das duas bactérias isoladamente e em conjunto, demostrando que ambas foram capazes de formar um biofilme espesso, embora dependendo do meio de cultura usado. Curiosamente, quando as bactérias cresceram em conjunto, em apenas 48h verificou-se uma erradicação completa de A. baumannii causada pel P. aeruginosa. Após a caracterização dos biofilmes, foi avaliada a eficácia dos fagos no controlo de biofilmes de 24h, 72h e 7 dias. Embora se tenha observado uma redução significativa no número de células viáveis e biomassa total nas primeiras 3h e 6h de infeção dos biofilmes formados durante 24h e 72h para ambas as bactérias, após 24h de tratamento verificou-se uma proliferação de variantes resistentes aos fagos. Foi também observado que em biofilmes mais maduros (7 dias), geralmente houve uma menor suscetibilidade ao tratamento com os fagos, exceto quando cultivados em meio DMEM:F12. A eficácia dos fagos foi também avaliada em células epiteliais das vias respiratórias humanas, NuLi-1. O tratamento com fagos nas células epiteliais NuLi-1 colonizadas com cada uma das espécies bacterianas resultou numa redução significativa da morte celular, com um efeito mais prolongado do que a atividade dos fagos nas células bacterianas. Em conclusão, ambos os fagos revelaram ser não ser tóxicos para as células animais e uma abordagem promissora para o tratamento inicial de biofilmes e para o controlo de bactérias aderidas ao epitélio