Production of the flavor compound 2-phenylethanol by Yarrowia lipolytica

Dissertação de mestrado em BiotechnologyThe flavor compounds produced by biotechnological processes are widely accepted by consumers, since they are considered as “natural” compounds. In addition, they are of great interest due to the high yields and greener processes. 2-Phenylethanol (2-PE) is an aromatic alcohol with a delicate fragrance of rose petals, widely applied in diverse types of products. Although there are many works in the literature about 2-PE production by several yeasts’ strains, the non-conventional yeast Yarrowia lipolytica was poorly explored in this field, despite appearing to be a competitive producer. Thus, the main goal of this work is to develop a 2-PE production process, through L-phenylalanine (L-Phe) bioconversion, combining strain selection, medium composition and culture condition optimization and application of in situ product removal techniques (ISPR), using Y. lipolytica as a cell factory. Based on this, three Y. lipolytica strains (W29, NCYC2904 and CBS2075) were selected. Initially, it was studied the inhibitory effect of 2-PE and L-Phe on Y. lipolytica growth, and it was observed that all strains were inhibited by 2-PE concentrations equal or above 2 g L-1. Concerning the effect of L-Phe, a remarkable inhibitory effect on cell growth of NCYC2904 strain was detected for all concentrations tested, while W29 and CBS2075 strains were inhibited by 15 g L-1 of L-Phe. Thereafter, the ability of W29 and CBS2075 strains to produce 2-PE was assessed at shake flask-scale, with glucose as the carbon source. The W29 strain was selected for further studies since it produced the highest 2-PE titer (1.01 ± 0.07 g L-1). Afterwards, the influence of L-Phe concentration in the 2-PE production was also evaluated, and it was observed that an increase in the precursor concentration enhances the 2-PE concentration (1.57 ± 0.06 g L-1), bioconversion yield (0.28 ± 0.04 vs 0.23 ± 0.02 g g-1) and productivity (6.5 ± 0.3 vs 6.0 ± 0.4 mg L-1 h-1). 2-PE production with W29 strain was also studied at bioreactor level, and the effect of dissolved oxygen (DO) concentration and medium pH were evaluated. It was observed that increasing the DO concentration from 10 % to 30 % lead to a decrease in 2-PE titer (0.88 vs 0.71 g L-1), whereas a more acidic environment (pH 5) allow a high 2-PE titer (1.92 g L-1) and bioconversion yield (0.57 g g.1). Crude glycerol was tested as an alternative carbon source for 2-PE production, and a 33 % increase in 2-PE titer was observed with this carbon source. The effect of substrate concentration was also analyzed, and it was demonstrated that an increase in crude glycerol concentration did not enhance the L-Phe consumption efficiency nor the 2-PE concentration. It was also tested a bioconversion strategy coupled with product removal by adsorption, and the resin XAD-4 was chosen as the best adsorbent since it adsorbed most 2-PE and least L-Phe. The addition of 7 % (wet w/v) resin to the bioconversion system allowed a 1.2-fold increase in the 2-PE concentration compared to the bioconversion without addition of the adsorbent resin. These results show that the Y. lipolytica W29 strain is a promising microorganism for 2-PE production.Os aromas e fragrâncias produzidos por processos biotecnológicos são cada vez mais aceites pelos consumidores, uma vez que são considerados compostos "naturais". Além disso, os rendimentos obtidos são mais elevados e este bioprocesso é mais ecológico, tornando-o mais atrativo. O 2-feniletanol (2-FE) é um álcool aromático com uma delicada fragrância a pétalas de rosas, amplamente utilizado em diversos produtos. Embora existam muitos trabalhos na literatura que reportam a produção de 2-FE por várias estirpes de leveduras, a levedura não-convencional Yarrowia lipolytica foi pouco explorada nessa área, apesar de parecer um produtor competitivo. Assim, o principal objetivo deste trabalho consiste no desenvolvimento do processo de produção de 2-FE, por bioconversão da L-fenilalanina (L-Fe), combinando seleção de estirpes, otimização da composição do meio e condições de cultura e aplicação de técnicas de remoção de produto, utilizando a Y. lipolytica. Para tal, foram selecionadas três estirpes de Y. lipolytica (W29, NCYC2904 e CBS2075). Inicialmente, foi avaliado o efeito inibitório do 2-FE e da L-Fe no crescimento das diferentes estirpes, e verificou-se que concentrações de 2-FE iguais ou superiores a 2 g L-1 inibem completamente o crescimento de todas as estirpes. Em relação ao efeito da L-Fe, esta inibiu totalmente o crescimento da estirpe NCYC2904, em todas as concentrações testadas, e o crescimento das estirpes W29 e CBS2075 foi inibido para uma concentração de L-Fe de 15 g L-1. De seguida, a capacidade de produção de 2-FE pelas estirpes W29 e CBS2075 foi avaliada em matraz, com glucose como fonte de carbono. A estirpe W29 foi escolhida como a mais promissora uma vez que produziu a concentração mais elevada de 2-FE (1,01 ± 0,07 g L-1). Posteriormente, foi avaliado o efeito da concentração de L-Fe na produção de 2-FE, tendo-se verificado que o aumento da concentração do precursor favorece a produção (1,57 ± 0,06 g L-1), o rendimento (0,28 ± 0,04 vs 0,23 ± 0,02 g g-1) e a produtividade (6,5 ± 0,3 vs 6,0 ± 0,4 mg L-1 h-1). A produção de 2-FE pela estirpe W29 foi também estudada em biorreator, tendo sido avaliada a influência da concentração de oxigénio dissolvido (OD) e do pH na produção. Observou-se que um aumento na concentração de OD de 10 % para 30 % levou a uma diminuição na concentração de 2-FE (0,88 vs 0,71 g L-1), no entanto a acidificação do meio (pH 5) permitiu aumentar a produção de 2-FE (1,92 g L-1) e o rendimento (0,57 g g-1). O glicerol bruto foi também avaliado como fonte de carbono alternativa para a produção de 2-FE, sendo a concentração de 2-FE obtida com glicerol bruto 33 % superior à obtida com glucose. O efeito da concentração de substrato também foi estudado e foi possível observar que o aumento da concentração do glicerol bruto não aumenta a eficiência de consumo da L-Fe nem a concentração de 2-FE. Foi ainda testada uma estratégia de produção com remoção do produto por adsorção, tendo sido selecionada a resina XAD-4 uma vez que permitiu adsorver mais 2-FE e menos L-Fe. A adição de 7 % (húmido p/v) de resina ao meio de bioconversão permitiu aumentar em 1,2 vezes a produção de 2-FE quando comparada com os ensaios sem remoção de produto. Assim, o presente trabalho demonstra o potencial da estirpe Y. lipolytica W29 para a produção de 2-FE