Identifizierung von Membranproteinen, welche von oxidierten Phospholipiden modifiziert werden mittels Gelelektrophorese und Massenspektrometrie

Durch enzymatische oder chemische Oxidation von Phospholipiden, die mehrfach ungesättigte Fettsäuren enthalten, kommt es zu der Entstehung einer breiten Anzahl von fragmentierten und nicht fragmentierten Oxidationsprodukten. In hohen Konzentrationen sind diese oxidierten Phospholipide an zahlreichen pathophysiologischen Effekten beteiligt. In niedrigen Konzentrationen konnten auch positive (z.B. antiinflamatorische) Wirkungen beobachtet werden, die durch diese oxidierten Phospholipide hervorgerufen werden. Die elektrophilen Verbindungen sind in der Lage kovalente Bindungen mit nukleophilen Aminosäuren von Proteinen einzugehen. Durch diese Modifikation kann die Funktion der Proteine beeinflusst werden. Welche Proteine selektiv durch oxidierte Phospholipide modifiziert werden, ist jedoch relativ wenig erforscht. Ziel dieser Diplomarbeit war es Membranproteine zu identifizieren, welche durch oxidierten Phospholipide modifiziert werden. Da durch diese kovalente Bindung die Mobilität der Proteine bei der Auftrennung durch die Gelelektrophorese verändert wird, wurde ein Gel-Shift-Assay entwickelt. Jene Proteine, bei denen ein Bandenshift zu beobachten war, wurden tryptisch verdaut und mittels LC-MS/MS analysiert. Durch diese Methode konnte eine Vielzahl an Proteinen identifiziert werden, die als potentielle Kandidaten für eine Modifikation durch oxidierte Phospholipide in Frage kommen. Die Ergebnisse der Massenspektrometrie konnten mittels Western Blot bestätigt werden. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass dieser Gel-Shift-Assay in Kombination mit Massenspektrometrie zur Identifizierung von Proteinen, welche durch oxidierte Phospholipide modifiziert werden, gut geeignet ist.The enzymatic or chemical oxidation of phospholipids containing polyunsaturated fatty acids leads to the formation of a large number of fragmented and non-fragmented oxidation products. In high concentrations, these oxidized phospholipids are involved in numerous pathophysiological effects. At low concentrations, positive effects (e.g. anti-inflammatory) elicited by these oxidized phospholipids could also be observed. The electrophilic compounds are able to form covalent bonds with nucleophilic amino acids of proteins. This modification can alter the function of the proteins. However, which proteins are selectively modified by oxidized phospholipids is poorly understood. The aim of this diploma thesis was to identify membrane proteins that are modified by oxidized phospholipids. Because this covalent binding changes the mobility of the proteins when separated by gel electrophoresis, a gel-shift assay was developed. Those proteins that showed band shift were tryptically digested and analyzed by LC-MS / MS. By this method, a variety of proteins could be identified, which are potential candidates for modification by oxidized phospholipids. The results of the mass spectrometry could be confirmed by Western Blot. In conclusion, this gel-shift assay in combination with mass spectrometry is well suited for the identification of proteins modified by oxidized phospholipids.vorgelegt von David KürzlZusammenfassungen in Deutsch und EnglischAbweichender Titel laut Übersetzung des Verfassers/der VerfasserinKarl-Franzens-Universität Graz, Diplomarbeit, 2018(VLID)258147