Evaluation of C-prenylating enzymes for the heterologous biosynthesis of cannabigerolic acid

Aromatic prenyltransferases catalyze the prenylation of an electron-rich aromatic compound by a prenyl diphosphate by transfer a prenyl residue to carbon, nitrogen or an oxygen atom of the aromatic acceptor molecule. The bioactivity of the resulting products is often increased, compared to the non-prenylated substrates. Prenylation of aromatic compounds is important for the diversification of secondary metabolites like phytocannabinoids. The membrane-bound cannabigerolic acid synthase from Cannabis sativa catalyzes the prenylation of olivetolic acid (OA) with geranyl diphosphate (GPP) to form cannabigerolic acid (CBGA). CBGA is the central precursor of the main pharmacologically active compounds of C. sativa: Δ9-tetrahydrocannabinol (THC) and cannabidiol (CBD). A biotechnological production using heterologous yeast presents a promising alternative to meet the increasing pharmaceutical demand and interest in these cannabinoids. In this regard, this study aimed for the identification of potential aromatic prenyltransferases able to produce CBGA and their heterologous expression. Three different membrane-bound aromatic prenyltransferases, isolated from C. sativa, were expressed in Saccharomyces cerevisiae, but were not able to produce CBGA. Furthermore, the soluble aromatic prenyltransferase NphB, first isolated from Streptomyces sp. strain CL190, was investigated as an alternative. Beside the desired product CBGA, NphB forms a major side-product, 2-O-geranyl olivetolic acid. Therefore, NphB variants were tested in a low-throughput screening system in order to improve the product specificity towards CBGA and to enable higher specific activities. Additionally, the simultaneous functional expression of nphB and the final enzyme of the cannabinoid pathway, tetrahydrocannabinolic acid synthase (THCAS), in S. cerevisiae is presented. This study presented for the first time that the soluble aromatic prenyltransferase NphB produces CBGA from precursors OA and GPP. The obtained results therefore promote the generation of a cannabinoid producing yeast for a biotechnological approach in order to face the increasing demand of the phytocannabinoids CBD and THC in the medical sector.Aromatische Prenyltransferasen biokatalysieren die Prenylierung eines Elektronen-reichen Aromaten mit Hilfe eines Prenyldiphosphates durch die Übertragung des Prenylrestes auf ein Kohlenstoff-, Stickstoff- oder Sauerstoffatom des aromatischen Akzetormoleküls. Prenylierte Substanzen weisen oft eine höhere Bioaktivität als die entsprechenden nicht-prenylierten Moleküle auf. Die Prenylierung von Aromaten ist wichtig für die Vielfalt von Sekundärmetaboliten wie Phytocannabinoiden. Die Membran-gebundene Cannabigerolsäure Synthase (CBGAS) aus Cannabis sativa biokatalysiert die Bildung von Cannabigerolsäure (CBGA) durch die Prenylierung von Olivetolsäure (OA) mit Geranyldiphosphat (GPP). CBGA ist das zentrale Intermediat für die pharmakologisch aktiven Substanzen Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC) und Cannabidiol (CBD) aus C. sativa. Eine biotechnologische Produktion mit Hilfe von heterologen Wirtszellen wie Hefe stellt eine vielversprechende Alternative dar, um dem steigenden pharmazeutischen Bedarf und Interesse an diesen Cannabinoiden gerecht zu werden. Im Hinblick darauf sollten im Rahmen dieser Arbeit potentielle aromatische Prenyltransferasen identifiziert und heterolog exprimiert werden, die in der Lage sind CBGA zu produzieren. Drei unterschiedliche Membran-gebundene aromatische Prenyltransferasen aus C. sativa wurden in Saccharomyces cerevisiae exprimiert, es konnte aber keine CBGA Produktion nachgewiesen werden. Als Alternative zur CBGAS wurde die lösliche aromatische Prenyltransferase NphB aus Streptomyces sp. strain CL190 in Betracht gezogen. NphB bildet hauptsächlich 2-O-geranyl Olivetolsäure und CBGA nur als Nebenprodukt. Mit Hilfe eines Screening Systems sind verschiedene NphB Mutanten im Hinblick auf verbesserte Produktspezifitäten und höhere spezifische Aktivitäten untersucht worden. Des Weiteren wird die funktionale Expression von nphB sowie die co-Expression von nphB und dem finalen Enzym des Cannabinoid Biosyntheseweges, Tetrahydrocannabinolsäure Synthase (THCAS), in S. cerevisiae präsentiert. Die vorliegende Arbeit zeigt zum ersten Mal, dass die lösliche aromatische Prenyltransferase NphB die Bildung von CBGA aus OA und GPP biokatalysiert. Die gezeigten Ergebnisse unterstützen die Entwicklung einer Cannabinoid-produzierenden Hefe für die biotechnologische Produktion der pharmazeutisch bedeutsamen Phytocannabinoide CBD und THC