Bacillus subtilis RecA accessory proteins at the stage of homology search during natural transformation

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 29-11-2018Esta tesis tiene embargado el acceso al texto completo hasta el 29-05-2018La transformación natural se clasifica en transformación cromosómica y transformación plasmídica. Durante la transformación cromosómica, el ssADN internalizado es integrado en el cromosoma homólogo recipiente via recombinación homóloga mediada por RecA, mientras que durante la transformación plasmídica, el ADN plasmídico heterólogo puede ser reconstruido a su forma de dsADN mediante proteínas que catalizan anillamiento de cadenas y replicación, en un proceso independiente de RecA. Los dos primeros capítulos de esta tesis se centraron en el estudio de: (i) el impacto de las secuencias divergentes de ADN como barrera a la recombinación genética interespecies (Capítulo 1) y (ii) si las proteínas del sistema de reparación de bases desapareadas (MMR), MutSL, regulan la recombinación genética entre secuencias divergentes de ADN (Capítulo 2) durante la transformación cromosómica natural en la bacteria Bacillus subtilis, perteneciente al filo Firmicutes. Análisis genéticos previos han mostrado que: (i) la ausencia de la proteína RecA bloquea la transformación cromosómica pero no afecta a la transformación plasmídica; (ii) la proteína RecU tiene un papel en transformación plasmídica y (iii) las proteínas DprA y RecX, son cruciales tanto en transformación cromosómica como en plasmídica. Para aumentar nuestro conocimiento acerca del papel de las proteínas RecX y RecU durante la transformación natural, el mecanismo de nucleación y filamentación de RecA en presencia de SSBs (SsbA, SsbB) y RecX (Capítulo 3) o RecU (Capítulo 4), fue estudiado in vitro. Además, se estudió si la proteína específica de competencia, DprA, podría revertir el efecto negativo de estos moduladores. Los resultados obtenidos en esta tesis muestran que: (i) la divergencia de secuencias previene la transformación cromosómica de B. subtilis en un modo bifásico, sugiriendo dos mecanismos distintos de integración de ADN divergente. Secuencias con hasta un 15% de divergencia, proveen una barrera a la transformación cromosómica, la cual disminuye logarítmicamente mientras que la longitud del ADN integrado se reduce aritméticamente, mediante un mecanismo de intercambio de cadenas dependiente de homología mediado por RecA. Sin embargo, cuando la divergencia de secuencia es superior a 15%, la longitud del ADN integrado es independiente de la divergencia de secuencia, pudiendo ser la recombinación ilegítima facilitada por homología el mecanismo responsable de la integración en este caso; (ii) la ausencia de las proteínas de MMR, contribuye marginalmente al primer mecanismo, pero promueve el segundo. (iii) ~23% de divergencia de secuencia debería proporcionar el límite para restaurar genes inactivados por transformación; (iv) RecA puede catalizar el intercambio de cadenas de ADN de manera bidireccional; (v) RecX y RecU contribuyen positivamente a la transformación plasmídica pero negativamente a la cromosómica; (vi) el mediador DprA-SsbA, contribuye a la formación de un filamento de RecA activo que directamente antagoniza el efecto negativo de RecX durante la transformación cromosómica; (vii) DprA es necesario y suficiente para revertir el efecto negativo de RecU sobre RecA durante la transformación cromosómica y (viii) durante la transformación plasmídica, RecX y/o RecU promueven el desensamblaje de RecA del ADN heterólogo (plasmídico) y DprA promueve el anillamiento de las cadenas complementarias uniéndose a ellasEster Serrano Alvarez ha disfrutado de una beca de “Ayudas para contratos predoctorales para la formación de doctores” (Referencia de la Ayuda: BES-2013-063433) perteneciente al Subprograma Estatal de Formación del Ministerio de Economía y Competitividad (actual Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades) y una beca de “Ayudas a la movilidad predoctoral para la realización de estancias breves en centros I+O españoles y extranjeros 2014” (Referencia de la ayuda: EEBB-l-15-10199) perteneciente al Subprograma Estatal de Movilidad del Ministerio de Economía y Competitividad (actual Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades