Isolation, characterization and Ex-Vivo expansion of human synovial tissue derived-mesenchymal stem/stromal cells

Tese de mestrado integrado Engenharia Biomédica e Biofísica (Sinais e Imagens Médicas), apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2013As células estaminais mesenquimais ou mesenquimatosas (do inglês ‘mesenchymal stem cells’, MSCs) são actualmente alvo de investigação intensa a nível mundial, devido às suas inúmeras propriedades já conhecidas, com potenciais aplicações no campo da medicina regenerativa e na engenharia de tecidos e órgãos artificiais. A definição actualmente aceite para células estaminais permite definir duas características universais deste tipo de células. Por um lado, apresentam a capacidade de se auto-renovarem de forma ilimitada, exibindo também a capacidade de se diferenciarem num ou mais tipos de células especializadas, de diferentes linhagens. De acordo com os tipos de células estaminais reconhecidos, as células estaminais mesenquimais são consideradas células estaminais adultas, que residem virtualmente em todos os órgãos do organismo humano. No entanto, embora morfologicamente semelhantes, as células estaminais do mesênquima isoladas de diversas fontes podem ser funcionalmente diferentes, e sabe-se que esta população celular apresenta características distintas consoante a sua localização ou nicho no organismo. No entanto, é globalmente aceite que o seu propósito concentra-se na manutenção fisiológica dos tecidos e órgãos onde estão presentes, com a capacidade de reparar lesões nos tecidos em caso de trauma. Por outro lado, devido a estudos in vitro realizados, o reconhecimento do potencial terapêutico e as possibilidades de utilização destas células foram aprofundados. Actualmente, a sua utilização clínica é reconhecida em várias patologias e doenças, como por exemplo, a doença do enxerto contra o hospedeiro (do inglês ‘graft-versus-host disease’, GvHD). As células estaminais do mesênquima têm a capacidade de modelar selectivamente e de forma considerável as respostas imunes do hospedeiro, e é esse o fundamento para a sua utilização no tratamento de patologias auto-imunes. Através de secreção de factores solúveis (prostaglandinas, várias interleucinas, factores de crescimento, angiogénicos, antifibróticos, antiapoptóticos, por exemplo) e de interacções directas com células do sistema imunitário, apresentam propriedades antiinflamatórias e imunomoduladoras predominantes, com capacidade de suprimir a actividade de linfócitos T citotóxicos, linfócitos B e linfócitos NK, contribuindo para um estado regulador e supressor das respostas imunes. Considerando os fins terapêuticos descritos, as células estaminais do mesênquima são normalmente isoladas através de biópsias da medula óssea e do tecido adiposo, no primeiro caso através de procedimentos considerados invasivos e no segundo através de métodos de rotina durante lipoaspirações. Uma fonte alternativa para este tipo de células está actualmente a ser explorada na matriz do cordão umbilical, cujos tecidos são normalmente descartados após o parto. No entanto, embora o seu potencial clínico seja reconhecido, o número de células estaminais mesenquimais existentes em cada organismo é consideravelmente reduzido. As doses clínicas actualmente aceites estipulam a utilização entre 1 a 5 milhões de células por quilograma de massa corporal do doente. Torna-se assim essencial o desenvolvimento de estratégias que permitam a expansão ex-vivo deste tipo de células, mantendo a sua qualidade e ao mesmo tempo assegurando o cumprimento de normas internacionais para a sua utilização clínica. As células estaminais do mesênquima tradicionalmente isoladas a partir da medula óssea possuem uma elevada capacidade de expansão em cultura, podendo inclusive ser estimuladas para adquirir propriedades específicas. Diversos cocktails de citocinas podem ser adicionados aos meios de cultura utilizados, induzindo a proliferação ou a diferenciação numa linhagem particular, originando células especializadas e que possuem as características próprias de um órgão ou tecido. Por outro lado, a utilização de terapias génicas está actualmente a ser analisada, com a utilização de células estaminais do mesênquima como vectores, que expressam um gene de interesse transientemente numa região específica do organismo. Neste trabalho pretendeu-se analisar e estudar as características particulares de uma nova fonte de células estaminais do mesênquima, os tecidos sinoviais existentes nas cartilagens articulares. É actualmente postulado que as células estaminais mesenquimais derivadas dos tecidos sinoviais poderão apresentar características bioquímicas relevantes (por exemplo, secreção de factores anti-inflamatórios), e um potencial de diferenciação condrogénico superior relativamente às fontes clássicas. Esta possibilidade torna-se particularmente pertinente no tratamento de patologias osteocondrais, uma vez que as terapêuticas actualmente utilizadas visam a atenuação de sintomas e não o tratamento efectivo das causas subjacentes. As patologias associadas à degeneração da cartilagem, principalmente osteoartrite, tornam-se mais frequentes a nível mundial com o envelhecimento da população. Devido à sua natureza avascular e aneural, a cartilagem apresenta um potencial de regeneração limitado e os procedimentos terapêuticos actualmente aceites consistem na implantação autóloga de condrócitos, recolhidos de um local não sujeito a forças compressivas da articulação, seguido da sua expansão ex-vivo em laboratório. Embora praticável, esta técnica não permite responder a todas as limitações e problemas relacionados com a etiologia das patologias em questão. Neste trabalho foram utilizadas amostras biológicas recolhidas através de biópsias realizadas durante cirurgias artroscópicas de rotina no Centro Hospitalar de Lisboa Ocidental (Hospital de Egas Moniz e Hospital São Francisco Xavier). Foram considerados dadores com degeneração e processos inflamatórios associados à cartilagem, bem como dadores saudáveis, sem patologias permanentes e de longa duração associadas à cartilagem, embora com lesões traumáticas. Foram seleccionados 19 dadores, com idades entre os 20 e 78 anos (9 do sexo masculino). De cada dador foram recolhidas biópsias directas da membrana sinovial, com extracção na bursa suprapatelar. Foram ainda recolhidos os resíduos restantes do sistema shaver utilizado durante a artroscopia. Nos dadores com processos inflamatórios e edema da cavidade sinovial procedeu-se igualmente à recolha do fluido sinovial, onde também se encontram células mesenquimais em circulação. É importante salientar que a recolha do fluido sinovial não foi possível em dadores sem processos inflamatórios associados à cartilagem. Nestes dadores, o fluido apresenta apenas um volume residual cuja função é lubrificar as superfícies articulares durante o movimento. O isolamento das células estaminais mesenquimais a partir das biópsias recolhidas permitiu estimar uma taxa de sucesso entre os 75 e 100%, com eficiências maiores nos dadores mais jovens. O tempo de isolamento na passagem inicial foi consideravelmente longo, comparado com outras fontes de células estaminais mesenquimais, com uma duração entre 21 e 37 dias. Foram realizadas cinéticas de crescimento em diferentes condições, num regime estático e dinâmico. A densidade inicial de plaqueamento é relevante quando se pretende expandir células em cultura, cujo objectivo em diversas aplicações clínicas (por exemplo, tratamento de doenças e patologias osteocondrais) será a obtenção do maior número de células no menor intervalo de tempo possível. Uma densidade inicial de 3 000 células/cm2 revelou o melhor desempenho entre outras densidades possíveis, não comprometendo uma sinalização intercelular deficitária nem uma inibição de crescimento por contacto directo com células vizinhas. As condições hipóxicas (2 – 10% O2) são consideradas uma propriedade biológica presente na maior parte dos órgãos. Foi demonstrado que a cultura de células em tensões reduzidas de oxigénio permite uma expansão mais eficiente, prevenindo ainda vários processos de degeneração e senescência celular, permitindo obter células com características mais próximas daquelas que existem in vivo. Cinéticas de crescimento realizadas em hipóxia das células recolhidas a partir dos tecidos sinoviais permitiram obter resultados semelhantes aos existentes na literatura para outras fontes (particularmente medula óssea). Um crescimento num ambiente com 2% de oxigénio permitiu obter uma proliferação mais elevada (42 ± 3) face às condições de normóxia (fold increase: 25 ± 5) ao fim de 12 dias. A expressão dos marcadores celulares recomendados internacionalmente, que permitem a identificação de populações de células estaminais mesenquimais, também foi quantificada por citometria de fluxo. As células isoladas expressaram os marcadores CD73, CD90 e CD105, simultaneamente com expressão negativa de marcadores associados a linhagens hematopoiéticas, entre outras. As capacidades multipotentes destas células foram avaliadas pela indução da diferenciação nas três linhagens clássicas para células do mesênquima: osteogénica, condrogénica e adipogénica. Os resultados obtidos parecem sugerir que as células mesenquimais derivadas dos tecidos sinoviais apresentam um potencial de diferenciação condrogénico superior face às outras fontes, o que se poderá revelar particular útil em terapias celulares futuras no tratamento de várias patologias osteocondrais. Para maximizar a expansão ex-vivo em condições estáticas foram testados diferentes substratos que permitem aumentar as taxas de adesão e proliferação celular em condições de cultura. A proteína fibronectina, abundante na matriz extracelular, revelou-se o melhor substrato para melhorar as condições de expansão, associado a uma densidade inicial de plaqueamento adequada. A utilização deste substrato de adesão permitiu aumentar o número de células obtidas num período de tempo menor (fold increase 28 ± 1 versus 19 ± 4 ao fim de 12 dias). Um sistema de cultura dinâmico em spinner flasks, utilizado microcarriers como substrato sólido também foi desenvolvido para maximizar a expansão ex-vivo destas células. Utilizando um meio de cultura sem soro e livre de substâncias xenogénicas, foi realizada a expansão de forma eficiente, simultaneamente com a manutenção das propriedades celulares características das células mesenquimais e do seu potencial de diferenciação. Os microcarriers utilizados foram revestidos com um substrato baseado num lisado plaquetário humano, utilizado como substituto de soro em meios de cultura. Um revestimento diferente foi também utilizado, com uma substância disponível comercialmente (CELLStart™) indicada para a expansão de células em condições de cultura sem soro adicionado. Após 12 dias em condições dinâmicas, o fold increase máximo obtido foi de 9.9 ± 0.8. Uma análise ao perfil metabólico das células também foi desenvolvida durante a expansão dinâmica. As taxas de consumo de glucose e produção de lactato calculadas permitiram evidenciar um metabolismo baseado na glicólise aeróbia para a produção de energia. Estes resultados sugerem que os tecidos sinoviais podem ser considerados uma fonte viável de células estaminais do mesênquima, com aplicações concretas na regeneração e tratamento de patologias osteocondrais. No entanto, as condições de expansão ex-vivo ainda necessitam de ser optimizadas, bem como os meios de cultura utilizados que ainda não são totalmente livres de factores xenogénicos. Os processos de isolamento também devem ser optimizados, o que permitirá obter o maior número possível de células a partir de uma única amostra, levando a uma maior eficiência dos processos de expansão.Increasing attention is now being given to the use of mesenchymal stem cells (MSCs) in cell therapies and tissue engineering approaches. Articular cartilage is a tissue which can benefit from the clinical application of stem cell research, due to its avascular and aneural nature, that impairs natural healing and regeneration processes. This project aims at the isolation, characterization and ex-vivo expansion of human mesenchymal stem cells (hMSCs) derived from both the synovium and the synovial fluid. The comparative characterization to the classical sources of hMSCs, which consists of umbilical cord matrix (UCM), bone marrow (BM) and adipose tissue (AT), is expected to create a sustainable technological platform for the clinical-scale production of hMSCs for cellular therapies with different applications. Isolation of hMSCs from synovial tissues had a success rate ranging from 75 to 100%, with a higher yield obtained from younger donors. Samples were obtained from 19 donors, age range 20-78 years (9 males). Isolation time and initial passage duration ranged between 21 – 37 days. Growth kinetics under different initial seeding densities have shown that the largest number of cells is obtained for an initial seeding density of 3 000 cells/cm2. Also, the growth in hypoxic conditions was evaluated, confirming previous results for the other sources, with a higher fold increase (42 ± 3) in a low-oxygen environment than in normoxic conditions (fold increase: 25 ± 5). Cell surface markers were identified by flow cytometry, confirming the expression of CD73, CD90 and CD105 while lacking classically defined negative markers for MSCs. The evaluation of differentiation capacity of these cells into three different lineages (osteogenic, chondrogenic and adipogenic) was also performed. Preliminary results have suggested that hMSCs isolated from synovial tissues have a superior chondrogenic differentiation potential, which is particularly useful for the treatment of osteochondral defects and diseases. For maximizing ex vivo expansion potential under static conditions, different surface coatings were tested. Fibronectin proved to be an efficient substrate for improving cell growth, along with an appropriate initial seeding density, which allows achieving higher cell numbers in shorter time periods (fold increase 28 ± 1 versus 19 ± 4 after 12 days). A dynamic, serum- and xeno-free culture system (spinner flasks) using microcarriers also proved to be effective in expanding synovium-derived MSCs, while maintaining desired cell properties and differentiation potential. Beads were coated either with HPL or a commercially available cell attachment substrate (CELLStart™), achieving a maximum fold increase of 9.9 ± 0.8 after 12 days of culture. Metabolic profiling was also performed under dynamic culture conditions. Analysis of glucose uptake and lactate production rates showed that cells rely mainly on aerobic glycolysis for the production of energy. These results suggest that synovial tissues can be seen as a viable source for adult mesenchymal stem cells, especially for tissue replacement strategies on osteoarthritic joints. Nevertheless, there is a need to optimize the ex-vivo expansion protocols and xenogenic-free culture media to achieve a considerable cell number for clinical applications. The isolation process must also be optimized, in order to obtain the highest possible number of cells from a single sample