Desarrollo de un protocolo de análisis de la expresión génica mediante «differential display» que reduce el número de falsos positivos

Entre los métodos empleados para los análisis de la expresión de genes, el método de "differential display" ha sido ampliamente utilizado y, a pesar del uso extendido de los "microarrays", es aún un método válido para el análisis con muestras cuyo transcriptoma es desconocido. Con el objeto de reducir el elevado número de falsos positivos que genera esta técnica, hemos optimizado el protocolo para reducir la posibilidad de generar falsos positivos. En primer lugar, hemos marcado radiactivamente el cebador oligo-dT con lo que los fragmentos de DNA identificados son extremos 3'-UTR de RNAm. Por muestra hemos realizado dos transcripciones inversas y dos reacciones de PCR en cada una de ellas. Para seleccionar un fragmento de DNA, debía estar diferencialmente expresado en las 4 reacciones de PCR. Por último, todos los fragmentos fueron clonados y secuenciados por triplicado. Estas modificaciones al protocolo nos ha permitido identificar 5 genes expresados diferencialmente entre células epiteliales de intestino en estado proliferativo y diferenciado