Caraterização farmacológica de um modelo in vitro do estado de mal epilético

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaA epilepsia é uma patologia crónica caracterizada por ataques epiléticos espontâneos. Esta patologia afeta aproximadamente 65 milhões de pessoas mundialmente. A hiperexcitabilidade é considerada um fator facilitador da génese/ propagação do ataque epilético. Em muitos dos pacientes epiléticos, é possível controlar as convulsões com medicamentos antiepiléticos convencionais que atuam como bloqueadores dos canais de sódio ou por aumento da função de GABA como neurotransmissor. No entanto, 30% dos doentes epiléticos tornam-se resistentes ao tratamento (farmacoresistência). Têm sido desenvolvidos vários modelos de epilepsia in vitro recorrendo a fatias do cérebro ou culturas neuronais, as quais permitem investigar os mecanismos responsáveis pelos ataques epiléticos. Mais especificamente, vários estudos têm demonstrado que a ativação de recetores ionotrópicos e metabotrópicos do glutamato, bem como os receptores TrkB que ligam ao BDNF, contribuem para a epileptogénese.Resultados não publicados do nosso laboratório mostraram oscilações sincronizadas de [Ca2+]i em neurónios do hipocampo em cultura incubados num meio sem magnésio, que mimetiza a fase de status epilepticus in vitro. Estas alterações nos níveis de cálcio intracelular, são possivelmente concomitantes com bursts na atividade elétrica celular. Este estudo teve como objetivo caracterizar mais exaustivamente este modelo, utilizando whole-cell patch clamp, de forma a investigar a natureza e os mecanismos responsáveis por ataques epiléticos. Além disto, investigámos as alterações na sinalização pelo BDNF induzidas por status epilepticus. Observámos que APV e CNQX, que inibem os recetores de glutamato do tipo NMDA e não-NMDA, respetivamente, reduzem a frequência de disparos de potenciais de ação durante a fase de status epilepticus. Em consonância, verificou-se que os bursts rítmicos que procedem o status epilepticus foram suprimidos na presença de APV e CNQX. Observámos também alterações no tau ascendente e descendente dos potenciais de ação durante e após o status epilepticus, apesar dos resultados obtidos não serem estatisticamente significativos. Os resultados obtidos sugerem também que os recetores de glutamato podem influenciar a fase de hiperpolarização do potencial de ação sob condições que mimetizam status epilepticus, sendo que a contribuição dos recetores não-NMDA foi mais proeminente.Considerando o papel do BDNF no processo de epileptogénese, investigamos as alterações nos níveis de fosforilação dos recetores para a neurotrofina em neurónios do hipocampo incubados em condições que mimetizam in vitro as condições de status epilepticus. Observou-se um pequeno aumento da fosforilação do recetor TrkB, ainda que não significativo, durante a fase de status epilepticus. Curiosamente, este efeito não foi abolido por TrkB-Fc, uma proteína de fusão que liga BDNF livre impedindo a ativação do recetor TrkB pela neurotrofina. Estes resultados sugerem que pode haver outros mecanismos envolvidos na fosforilação dos recetores TrkB na ausência de BDNF durante a fase de status epilepticus.Futuramente, o modelo implementado neste trabalho pode contribuir para a compreensão dos mecanismos responsáveis pela atividade epilética. Este estudo pode também contribuir para o desenvolvimento de novas terapias para uma melhor atuação na fase de status epilepticus.Epilepsy is a chronic condition characterized by recurrent unprovoked seizures. The disease affects approximately 65 million people worldwide. Hyperexcitability is considered as the permissive factor for the genesis/propagation of epileptic seizures. In many epileptic patients, seizures are controlled with conventional antiepileptic drugs that act by blocking sodium channels or by enhancing the function of GABA as a neurotransmitter. However, 30% of epileptic cases become resistant to the treatment (pharmacoresistance). Several in vitro models of epilepsy were developed in the past, using brain slices or cultured neurons, to investigate the mechanisms underlying seizures. Different factors were found to be involved in the pathogenesis of epilepsy. In particular, numerous studies have shown that activation of ionotropic and metabrotopic glutamate receptors, as well as the TrkB receptors for BDNF, contribute to epileptogenesis.Non-published results from our laboratory showed synchronous [Ca2+]i transients in cultured hippocampal neurons incubated transiently in a magnesium-free medium, to mimic Status Epilepticus in vitro. These alterations in intracellular calcium levels are possibly concomitant with bursts in electrical activity. In this study, we aimed to further characterize this model through whole-cell path clamp, investigating the nature and the mechanisms behind seizures. Moreover, we investigated the alterations in BDNF signaling induced by Status Epilepticus. We observed that APV and CNQX, which inhibit NMDA and non-NMDA glutamate receptors, respectively, reduce the firing rate during status epilepticus. Likewise, we found that the rhythmic burst activity following status epilepticus was prevented by APV and CNQX. Additionally, we observed alterations in the rise and decay tau of the action potentials during and after status epilepticus, which however were not statistically significant. NMDA and non-NMDA glutamate receptors may also influence the hyperpolarization phase of the action potential under conditions mimicking Status Epilepticus, being the contribution of the latter receptor population more robust. Given the role of BDNF in epileptogenesis, we investigated the putative alterations in the phosphorylation of the TrkB receptors for the neurotrophin in cultured hippocampal neurons subjected to in vitro Status Epilepticus. An increase in TrkB phosphorylation was observed under these conditions, but the effect was not statistically significant. Interestingly, this effect was not abrogated by TrkB-Fc which chelates free BDNF and prevents the activation of TrkB receptors by the extracellular neurotrophin. These results suggest that there might be other mechanisms involved in phosphorylating TrkB receptors in the absence of BDNF during status epilepticus.Future follow up studies using the model implemented in this work may contribute to the understanding of the mechanisms underlying seizure activity. This work may also lead to the development of new therapies to better act on Status Epilepticus.Outro - This work was supported by grants from the Portuguese Science and Technology Foundation (FCT), European Union – European Fund for Economic and Regional Development funding (Operational Competitiveness Program [COMPETE] grants PEst-C/SAU/LA0001/2013-2014, UID/NEU/04539/2013 and UID/BIM/4501/2013) and Liga Portuguesa Contra a Epilepsia