Avaliação da capacidade de transporte e entrega de material genético promovida por nanossistemas de base polimérica

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaA terapia génica é uma estratégia terapêutica bastante promissora, que permitenão só tratar, como também prevenir ou eliminar as causas de uma patologia, alterandoo atual paradigma da medicina. Esta modalidade terapêutica tem sido aplicada em diversas patologias, de origem hereditária ou multifactorial. No entanto, o desenvolvimento de sistemas de transporte e entrega de material genético seguros e eficazes continua a ser um dos principais desafios para a sua implementação clínica.Embora a eficácia dos vetores não-virais seja inferior à dos vetores baseados emvírus, estes apresentam algumas vantagens, quando comparados com os vetores virais,como por exemplo a baixa imunogenicidade, facilidade de produção, estabilidade, e acapacidade de transportar sequências nucleotídicas maiores. Entre os vectores não virais,os sistemas de base polimérica têm-se revelado vetores bastante promissores para o transporte e entrega de material genético, destacando-se pela sua versatilidade, pela variedade de métodos de síntese disponíveis e pela facilidade de funcionalização química, que permitem a optimização da sua relação estrutura/atividade, a fim deincrementar a eficácia do nanossistema. Nexte contexto, o objectivo deste trabalho consistiu em desenvolver umnanossistema de transporte e entrega de material genético de base polimérica, eficaz e inovador, que induzisse uma elevada expressão do transgene, aliada a uma reduzidacitotoxicidade.Deste modo, avaliou-se atividade biológica de poliplexos baseados no polímeropoli(metacrilato de 2-aminoetil) (PAMA), com diferentes pesos moleculares ecopolimerizado com o polietilenoglicol (PEG). Foram também avaliados outrosparâmetros como a sua citotoxicidade e a capacidade de condensação do ADN. Osresultados obtidos, na presença de soro, demonstraram que os copolímeros em blocoPEG-b-PAMA, promovem a formação de poliplexos com uma capacidade de transfeçãosuperior à dos poliplexos baseados, exclusivamente, nos homopolímeros PAMAcorrespondentes. A copolimerização com o PEG promoveu, também, a diminuição dacitoxicidade dos poliplexos. Ainda assim, e embora os poliplexos baseados nocopolímero PEG-b-PAMA28900 demonstrassem uma eficácia de transfeção bastantesuperior à obtida com a referência padrão dos sistemas de base polimérica, apolietilenimina ramificada (bPEI), estes nanossistemas induziram níveis decitotoxicidade demasiado elevados, que comprometem a sua aplicação in vivo.Assim sendo, posteriormente, foi avaliada a capacidade de transporte e entregade material genético de poliplexos baseados na combinação dos polímerospoli(metacrilato de etilo-2-dimetilamino) (PDMAEMA) e poli(ß-amino éster) (PßAE),em diferentes proporções. Para tal, avaliou-se a atividade biológica e a citotoxicidade das formulações em várias linhas celulares e analisou-se o seu mecanismo de internalização celular. Procedeu-se ainda à caracterização físico-química das formulações preparadas com a combinação mais promissora, tendo sido avaliado o tamanho, a carga superficial e a capacidade de condensação/proteção do ADN. Os resultados obtidos demonstraram que a combinação dos polímeros PDMAEMA e PßAEconduz à formação de poliplexos que tem a capacidade de entregar o material genéticono núcleo. Os poliplexos preparados com a combinação PDMAEMA:4PßAE, na razãode carga N/P 25/1, foram selecionados como a melhor formulação, devido à sua elevadacapacidade de transfeção, mesmo na presença de soro, e aos reduzidos níveis decitotoxicidade. Adicionalmente, os outros ensaios experimentais demonstraram que ospoliplexos baseados nesta combinação de polímeros são internalizados,maioritariamente, por endocitose mediada por clatrinas, promovendo a expressão dotransgene numa elevada percentagem de células. Para além disso, estes nanossistemasapresentam uma elevada proteção de material genético e um tamanho reduzido,características estas favoráveis à sua aplicação in vivo.Gene therapy is a very promising therapeutic strategy that allows not only totreat but also to prevent or eliminate the causes of a disease, changing the currentmedicine’s paradigm. This therapeutic technique has been applied in severalpathologies, from hereditary to multifactorial diseases. However, the development ofsafe and effective gene delivery systems remains one of the main challenges to itsclinical application.Although non-viral delivery systems are less effective than the viral ones, theyoffer several advantages, when compared to viral vectors, including lowimmunogenicity, ease in production, stability, and higher capacity to carry nucleicacids. Among non-viral vectors, polymeric-based ones have emerged as promisingsystems for the transport and delivery of genetic material. These gene carriers areadvantageous especially due to their versatility, the number of synthetic methodsavailable and the facile chemical functionalization, which allows the optimization oftheir structure/activity relationship in order to increase the efficiency of the nanosystem.In this context, the aim of this work was to develop a novel and effectivepolymeric-based gene delivery system, which would induce a high expression of thetransgene with reduced cytotoxicity.Therefore, the biological activity of polyplexes based on poly(2-aminoethylmethacrylate) (PAMA) polymer, with different molecular weights and copolymerizedwith polyethylene glycol (PEG), was evaluated. Other parameters, such as itscytotoxicity and the ability to condense DNA, were also tested. The results obtained in the presence of serum demonstrated that PEG-b-PAMA block copolymer promotes theformation of polyplexes with higher transfection activity than the correspondinghomopolymer PAMA-based polyplexes. The copolymerization with PEG also promoteda decrease of cytoxicity of the polyplexes. Nevertheless, and although the PEG-b-PAMA28900-based polyplexes demonstrated a transfection efficiency much higher thanthe obtained with the standard reference of the polymer-based systems, the branchedpoly(ethyleneimine) (bPEI), these nanosystems induced high levels of cytotoxicity,which compromise their in vivo application.Therefore, the ability to transport and deliver genetic material associated topolyplexes based on a combination of different proportions of poly(ß-amino ester)(PßAE) and poly[2-(dimethylamino)ethyl methacrylate] (PDMAEMA) was evaluated.For this purpose, the biological activity and the cytotoxicity of the formulations were evaluated in different cell lines and their mechanism of cellular internalization was also studied. The physicochemical characterization of the most promising formulations was performed in order to obtain the size, surface charge and condensation/protection abilityof the DNA. The obtained results demonstrated that the combination of PDMAEMAand PßAE polymers leads to the formation of polyplexes that have the ability to deliver the genetic material into the nucleus. The polyplexes prepared with the combination PDMAEMA: 4PßAE, in the N/P 25/1 ratio, were selected as the best formulation due to their high transfection activity, even in the presence of serum, and their reduced levels of cytotoxicity. In addition, the other experimental studies have demonstrated that these polyplexes based on this combination of polymers are internalized mostly by clathrinmediated endocytosis, promoting the transgene expression in a high percentage of cells.Moreover, these nanosystems present a high protection of genetic material and reducedsize, which are suitable physicochemical properties for in vivo applications