Estado energético neuronal e a doença de Alzheimer: Qual a relação ?

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaA doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa sendo a forma mais comum de demência entre a população idosa. Evidências demonstram que disfunções metabólicas, tais como a deficiente utilização da glicose e a desregulação do metabolismo energético, são factores de risco para o défice cognitivo e a DA. Para além disso, estudos mostram que estas anomalias estão intimamente relacionadas com o aumento excessivo da produção de espécies reativas de oxigénio (reactive oxygen species; ROS), que se encontram associado com as alterações sinápticas na DA. Nesta linha, estudos demonstraram que as proteinas desacopladoras (uncoupling proteins, UCPs) evoluíram como mecanismo de defesa capaz de regular a produção de ROS e exercer um efeito neuroprotetor em várias situações lesivas para os neurónios. Assim, este trabalho teve como principal objectivo explorar a influência que o estado energético neuronal tem no surgimento dos principais marcadores neuropatológicos da DA e avaliar a sua correlação com a atividade e/ou expressão da UCP2. Para tal, usámos a linha celular SH-SY5Y diferenciada que foi exposta a diferentes níveis de glicose ((glicose elevada (high glucose, -HG); glicose baixa -(low glucose, LG) e ausência de glicose (no glucose,NG) durante dois períodos de incubação, 6h e 24h. Adicionalmente, para investigar o potencial papel neuroprotector da proteína UCP2 foi utilizado o seu inibidor farmacológico genipina (GNP). Os parâmetros avaliados foram os seguintes: viabilidade celular, a produção de ROS mitocondrial, o potencial membranar mitocondrial (ΔΨm), níveis de expressão das proteínas envolvidas na dinâmica mitocondrial, das proteínas UCPs neuronais, dos marcadores neuropatológicos da DA, de algumas proteínas relacionadas com esta mesma doença assim como um marcador sináptico.Observámos que o período de exposição aos insultos metabólicos origina respostas celulares distintas. Especificamente, observámos que os níveis dos marcadores associados à DA (APP e p-Tau (Ser396)) encontram-se aumentados em células expostas a LG e NG durante 6h enquanto às 24h de incubação apenas as células expostas a NG apresentou um aumento nos níveis destas proteínas. Observámos também que independentemente do período de incubação, a exposição a diferentes níveis de glicose exerceu diferentes respostas celulares. Especificamente, observámos que a capacidade oxidativa/redutora das células apenas foi afetada pela condição de NG (às 6h e 24h) que também provocou um aumento de fissão mitocondrial (às 24h). Além disso, verificámos também que a exposição das células neuronais a condições de LG e NG promoveu um aumento significativo dos níveis mitocondriais de ROS e dos níveis proteicos de UCP4 e UCP5 (predominantemente às 24h). Adicionalmente, a inibição da atividade da UCP2 potenciou algumas das alterações ocorridas no grupo exposto a LG, causando um aumento nos níveis mitocondriais de ROS e nos níveis de expressão da APP (24h) e da p-Tau (Ser 396) em ambos os períodos de incubação. Observámos também que às 6h, estas alterações foram acompanhadas por um aumento significativo da fissão mitocondrial (através da análise dos niveis da p-DRP1 (Ser 616)) e das proteínas envolvidas na fusão mitocondrial (OPA1, Mfn 1 and Mfn2), o que pode representar uma tentativa das células em manter o correto funcionamento e integridade mitocondrial. Resultados semelhantes foram observados no grupo submetido à condição de NG. Por outro lado, às 24h, a inibição da atividade da UCP2 causou um aumento significativo nos níveis de expressão da APP e uma diminuição nas proteínas de fissão-fusão. Para além disso, apesar de não termos detetado nenhuma alteração no grupo sujeito a HG, a inibição da UCP2 comprometeu significativamente a resposta das células expostas a este insulto. Em particular potenciou a produção de ROS mitocondrial; o ΔΨm (às 24h); os níveis de expressão das proteínas APP (às 24h); p-Tau(Ser396), UCP4, UCP5 (às 6h), p-DRP1(Ser616) (às 24h) e PSD95 (às 24h) assim como um aumento significativo da fissão mitocondrial (às 24h). Curiosamente, os resultados sugerem que a inibição da atividade da UCP2 pode ser compensada, até certo ponto, por um aumento da expressão das outras UCPs neuronais. De fato, como podemos observar, após 6h de incubação, esta inibição foi compensada por um aumento na expressão da UCP2 e UCP4. Estas adaptações podem ser responsáveis pelo aumento observado na proteína PSD95. De realçar que o efeito da GNP como inibidor da atividade da UCP2 foi confirmado através da avaliação do seu efeito num grupo controlo. Desse modo, foi possível observar que a GNP per se promove o aumento de ROS mitocondrial e o ΔΨm, confirmando assim que a GNP exerce um efeito a nível celular e mitocondrial consistente com o efeito oposto à ação da UCP2.Em suma, os resultados obtidos neste trabalho mostram que o estado energético neuronal afecta o surgimento dos marcadores neuropatológicos da DA e que a UCP2 pode ter um papel protector nestas condiçõesAlzheimer’s disease (AD), a progressive neurodegenerative disease, is the most common form of dementia in the elderly. Evidence clearly demonstrates that metabolic abnormalities, such as reduced glucose utilization and energy dysmetabolism, are risk factors for cognitive impairment and AD. Those anomalies are closely associated with the overproduction of mitochondrial reactive oxygen species (ROS), which are implicated in synapse disruption in AD. In this scenario, compelling evidence shows that uncoupling proteins (UCPs) have evolved as a mechanism that regulate the rate of ROS production and exert (neuro)protection against a plethora of harmful insults. Following this rational, the present study is devoted to explore the influence of neuronal energy status in the development of AD-like pathology by exposing differentiated SH-SY5Y cells to different glycemic conditions (high glucose-HG; low glucose-LG and no glucose-NG). Further, to investigate the potential protective effect of UCP2 we used its pharmacological inhibitor genipin (GNP). To better dissect the possible occurring alterations, experiments were performed at two different time points, at 6 and 24h of incubation. The following parameters were analyzed: cells viability, mitochondrial ROS levels, mitochondrial membrane potential (ΔΨm), protein expression levels of mitochondrial dynamics (p-DRP1, OPA1, Mfn1, Mfn2), neuronal UCPs (UCP2, UCP4 UCP5), AD-related neuropathological hallmarks (p-Tau (Ser396), APP and BACE1), AD-related kinases (GSK3β, Cdk5 and p35/25) and synaptic integrity (PSD95).We observed that the incubation period causes distinct cellular responses. Namely, we found that the appearance of AD-related hallmarks APP and p-Tau (Ser 396) is markedly increased in both LG and NG exposed groups at 6h of incubation but after 24h only the NG group shows an increase in these markers. However, we did not find any significant alteration in the AD-related kinases analyzed under our experimental conditions. Still, we also observed that independently of the incubation period, the exposure to different glycemic conditions exert different responses in neuronal-like cells. Specifically, we found that cells redox capacity significantly decreased when exposed to a NG insult (at both 6h and 24h), which also caused an increased mitochondrial fission (at 24h) whilst no alterations were found in the HG and LG insults. Besides, we also observed that the exposure of neuronal cells to LG and NG groups promoted a significant increase in mitochondrial ROS levels, and in UCP4 and UCP5 protein levels at 24h. Further, UCP2 inhibition potentiated some of the occurring alterations in the LG exposed group by exacerbating ROS levels and p-Tau(Ser396) protein levels both at 24h and APP protein levels at 24h. We also found that at 6h, those alterations were accompanied by a significant increase in mitochondrial fission as evaluated by p-DRP1(Ser 616) protein levels that was compensated by a strong increase in mitochondrial fusion proteins (OPA1, Mfn 1 and Mfn2), thereby demonstrating an attempt of neuronal cells to keep mitochondria function and their integrity. Similar results regarding mitochondrial fusion proteins were detected in the NG exposed group. In turn, at 24h, UCP2 activity inhibition in the NG exposed group evoked a significant increase in APP protein levels and a decrease in fission and fusion protein levels. Moreover, albeit we did not detect any significant alteration in HG exposed group, UCP2 inhibition significantly impaired neuronal responses when facing this insult. Specifically, under this metabolic insult, GNP-induced UCP2 activity inhibition potentiated mitochondrial ROS levels, ΔΨm (at 24h) and APP (at 24h), p-Tau(Ser396), UCP4, UCP5 (at 6h), p-DRP1(Ser616) (at 24h) and PSD95 (at 24h) protein levels as a significant increase in mitochondrial fusion (at 24h). Interestingly, our results suggest that UCP2 activity inhibition can be compensated to a certain extent by an increased expression of the other neuronal UCPs. In fact, as shown, at 6h incubation, UCP2 inhibition in our experimental insults is compensated by increased levels of UCP2, and UCP4. These adaptations may be responsible for the increased levels of the neuronal integrity marker PSD95 found at 24h. Of note, GNP-induced UCP2 inhibition was confirmed by observing that in the control group, i.e. GNP per se increased mitochondrial ROS levels and ΔΨm, thus confirming that GNP is exerting an overall effect on mitochondrial and cellular function that is consistent with an effect that opposes UCP2 action.Altogether, our results suggest that neuronal energy status significantly affects the development of AD-like characteristics and that UCP2 may have an important role in protecting against those effects.Outro - Financiado por Fundos FEDER através do Programa Operacional Factores de Competitividade – COMPETE 2020 e por Fundos Nacionais através da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia no âmbito do projecto Estratégico com referência atribuida pelo COMPETE: POCI-01-0145-FEDER-007440