Efeito Citotóxico do Partenolide em Doenças Malignas em Doenças Malignas do Sistema Linfóide - Estudos in Vitro.

Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Molecular apresentada à Faculdade de Ciências e TecnologiaApesar de serem muito heterogéneos em termos de etiologia, morfologia, imunofenótipo e genótipo, os diferentes subtipos de neoplasias linfoides resultantes da transformação de linfócitos B e T durante a sua diferenciação e maturação, partilham uma resposta relativamente baixa/intermédia aos esquemas de quimioterapia convencionais e as recaídas são frequentes. A necessidade de novas terapêuticas implica estudos de medicamentos tais como o Portanto, novas alternativas terapêuticas ainda são uma necessidade. Assim, o Partenolide (PRT), um inibidor seletivo da via do fator nuclear kappa-B (NF-kB), que está intimamente associada ao desenvolvimento e agressividade tumoral, parece ser uma opção válida na melhoria das terapêuticas anticancerígenas, principalmente no que diz respeito às neoplasias hematológicas.Como tal, o objetivo deste estudo consistiu na avaliação do potencial terapêutico do PRT em modelos in vitro de leucemia linfoblástica aguda (LLA) e linfoma de Burkitt (LB), caracterizando-se o tipo de morte celular induzida e os mecanismos moleculares envolvidos.Com este intuito, uma linha celular de LB (as células RAJI) e cinco linhas celulares representativas de diferentes subtipos de LLA (as células 697, CEM, JURKAT, MOLT-4 e KOPN-8) foram incubadas na ausência ou presença de diferentes concentrações de PRT em administração única ou fracionada. O ensaio metabólico da resazurina foi utilizado para avaliar, indiretamente, o efeito deste fármaco na viabilidade celular. Quanto ao tipo de morte celular induzida, esta foi analisada por microscopia ótica, após coloração segundo o protocolo May-Grünwald Giemsa, e por citometria de fluxo (CF), utilizando a dupla coloração com anexina-V e 7-AAD.A CF foi ainda utilizada para esclarecer os mecanismos moleculares envolvidos [avaliação dos níveis de algumas proteínas apoptóticas (FAS, FAS-L e caspase-3) e da disrupção do potencial de membrana mitocondrial, recorrendo à sonda JC-1], bem como para avaliar o efeito do PRT no ciclo celular, e nos níveis de NF-kB fosforilado e de stresse oxidativo (quantificação dos níveis de superóxido, peróxido de hidrogénio e glutationa reduzida através da utilização das sondas DHE, DCFH2DA e alaranjado de mercúrio, respetivamente).Os resultados obtidos indicaram que o PRT reduzia a atividade metabólica de forma dependente do tempo de incubação, da dose administrada e da linha celular, sendo as células KOPN-8 as mais sensíveis. Tal pode estar relacionado com o tipo de célula, o genótipo e o estadio da patologia aquando do estabelecimento das linhas celulares (ao diagnóstico ou após uma recaída). Além disso, o ensaio metabólico da resazurina também evidenciou que os esquemas de administração única e fracionada eram semelhantes, indicando que a administração fracionada deve permanecer uma possibilidade terapêutica, uma vez que permite uma redução das complicações associadas à toxicidade da dose administrada. A marcação com anexina-V e 7-AAD demonstrou que o PRT tem principalmente um efeito citotóxico, induzindo morte celular preferencialmente por apoptose, o que foi confirmado por microscopia ótica, pelo aumento dos níveis de pró-apoptóticas e pela deteção do pico sub-G1 na análise do ciclo celular. Embora a morte celular por apoptose tivesse ocorrido em todas as linhas celulares estudadas, os mecanismos de ativação da caspase-3 foram distintos. Na verdade, a ativação da via extrínseca da apoptose através da interação entre a molécula FAS e o seu ligando estava envolvida na morte celular em todas as linhas celulares exceto nas células CEM e JURKAT. Contrariamente, a disrupção do potencial de membrana mitocondrial por níveis deletérios de espécies reativas de oxigénio e a consequente ativação da via intrínseca da apoptose esteve presente em todas as linhas celulares.A análise do ciclo celular evidenciou que a progressão do mesmo não foi igualmente afetada em todas as linhas celulares, sendo as células JURKAT e MOLT-4 as únicas em que foi o bloqueio do ciclo celular nas fases G1 e G2/M foi evidente.Para além disso, a diminuição dos níveis de p65 fosforilado evidenciou o envolvimento do PRT na inibição da proteína IKK, permitindo o sequestro do NF-kB no citoplasma e prevenindo, consequentemente, a transcrição dos vários genes que este fator regula (como vários genes associados à resistência à apoptose).Em conclusão, estes resultados sugerem que o PRT pode representar uma potencial abordagem terapêutica em neoplasias linfoides, apresentando um papel importante na regulação de uma via de sinalização celular fortemente relacionada com o controlo do crescimento e da morte celular. No entanto, a eficácia terapêutica pode depender do tipo celular e das características genéticas da neoplasia.Despite being very heterogeneous in terms of etiology, morphology, immunophenotype, and genotype, the distinct subtypes of lymphoid neoplasms resultant from B and T cell transformation at any point during its differentiation and maturation, share a relatively low/intermediate response rate to conventional chemotherapy regimens, and are frequently associated with relapse. Therefore, new therapeutic alternatives are needed. Thus, Parthenolide (PRT), a selective inhibitor of the nuclear factor kappa-B (NF-kB) pathway which is closely associated with cancer development and aggressiveness, seems to be a valid option for hematological cancer therapy improvement.As such, the aim of this study was to evaluate the therapeutic potential of PRT on acute lymphoblastic leukemia (ALL) and Burkitt lymphoma (BL) in vitro models, characterizing the type of cell death induced as well as its molecular mechanisms. For this purpose, one BL (RAJI cells) and five ALL (697, CEM, JURKAT, MOLT-4, and KOPN-8 cells) cell lines were incubated in absence or presence of different concentrations of PRT in single or daily administration. To indirectly evaluate the effect of this drug on cell viability, the resazurin metabolic assay was used. Cell death was analyzed by optical microscopy after smear staining according to May-Grünwald Giemsa protocol, and by flow cytometry (FC), using annexin-V/7-AAD double staining. Beside this, FC was also used to clarify the molecular mechanisms involved [quantification of some apoptotic proteins (FAS, FAS-L and caspase-3) and mitochondria membrane potential, using the JC-1 probe] as well as to evaluate PRT’s effect on cell cycle, phosphorylated NF-kB (p65) levels, and oxidative stress parameters (superoxide anion, hydrogen peroxide and reduced glutathione through the DHE, DCFH2DA and mercury orange probes, respectively).The results indicate that PRT reduced the metabolic activity in time, dose, and cell line dependent manner, being KOPN-8 cells the most sensitive. This result may be related with cell type, genetic background, and disease stage at cell line establishment (at diagnosis or after relapse). Besides this, resazurin metabolic assay also revealed that single and daily administration schemes gave similar results, indicating that daily administration should remain a possibility as it may enable a reduction in dose related systemic toxicity.Annexin-V/7-AAD staining demonstrated that PRT have mostly a cytotoxic effect, inducing cell death preferentially by apoptosis. These results were confirmed by optical microscopy, by the increased levels of pro-apoptotic molecules, and by the sub-G1 peak appearance in cell cycle analysis. Although cell death through apoptosis occurred in all cell lines, the mechanisms of caspase-3 activation were distinct, being cell line dependent. Indeed, extrinsic apoptotic pathway activation through FAS/FAS-L interaction was involved in all cell lines except in CEM and JURKAT. On the other hand, disruption of mitochondria membrane potential by deleterious levels of reactive oxygen species and intrinsic apoptotic pathway activation were also observed, even though to a different extent, in all cell lines.Besides this, PRT, as revealed by FC, affected cell cycle progression particularly in JURKAT and MOLT-4 cells, where a cell cycle arrest in G1 and G2/M was evident.Furthermore, the observed decrease in phosphorylated p65 levels evidenced the involvement of PRT in IKK inhibition, and consequently the NF-kB sequestering in the cytoplasm, preventing, thus, the transcription of the several genes regulated by the NF-kB pathways (e.g. the ones associated with apoptosis resistance).In conclusion, these results suggest that PRT may represent a potential new therapeutic approach in lymphoid malignancies, presenting an important role in the regulation of a cell signaling pathway that is tightly related with control of cell growth and death. However, therapeutic efficacy may depend on cell type and genetic characteristics of the neoplasm