Vascular Changes and Neurodegeneration in the Early Stages of Diabetic Retinopathy: Follow-up of Two Years

Dissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de MedicinaA incidência de Diabetes Mellitus (DM) tem aumentado nos últimos anos, com tendência para crescer na próxima década. As suas complicações, micro e macrovasculares, emergem como uma das maiores ameaças à saúde em todo o mundo, com grandes custos económicos e sociais.A Retinopatia Diabética (RD) é uma das principais complicações da DM. Apesar de avanços na metodologia de diagnóstico, que têm permitido elucidar melhor a sua fisiopatologia, e na aplicação de novas abordagens terapêuticas, a RD continua a ser a principal causa de cegueira em idade ativa nos países ocidentais (2-4). A RD tem sido classicamente considerada como uma doença microvascular da retina. No entanto, evidências recentes sugerem que a neurodegeneração da retina é um evento precoce na patogénese da RD e que poderá preceder o desenvolvimento das anomalias microvasculares (5-7).É essencial compreender a fisiopatologia da RD, não só para a gestão da doença, mas também para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas. A neurodegeneração retiniana em pacientes diabéticos é causada por mecanismos complexos, que incluem fatores oculares e sistémicos provocando alterações bioquímicas e celulares na retina. A hiperglicemia, ao interromper o delicado ambiente metabólico da retina, reduz os sinais do recetor da insulina, essenciais para o desenvolvimento, crescimento e sobrevivência neuronal, levando à apoptose neuronal (8). Outros fatores moleculares, como o aumento do stresse oxidativo, a inflamação, a perda de fatores neuroprotetores e a excitotoxicidade do glutamato também contribuem para o processo de neurodegeneração (7, 9-11). A tomografia de coerência ótica spectral domain (SD-OCT) e o eletroretinograma multifocal (ERGmf) têm sido utilizados de forma crescente na prática e na investigação clínica como métodos não invasivos e objetivos para avaliar a estrutura e função da retina. Estruturalmente, através de recentes software de segmentação do SD-OCT, tem sido possível fazer uma análise quantitativa e qualitativa da espessura de todas as camadas da retina. Por outro lado, funcionalmente, o ERGmf, através da análise do perfil da onda P1 (amplitude e tempo de latência), permite avaliar a resposta bioelétrica retiniana de forma localizada. Desta forma, pretendeu-se com este trabalho identificar alterações neurodegenerativas retinianas em 73 doentes diabéticos, 30 sem lesões de RD (nível ETDRS 10) e 43 doentes com RDNP ligeira (nível ETDRS 20-35), utilizando o SD-OCT e o ERGmf, durante um período de dois anos.Numa primeira análise (visita 1), observou-se, um maior tempo de latência e menor amplitude da onda P1 (p<0.001) nos doentes diabéticos sem RD e com RDNP ligeira, comparativamente ao grupo controlo. Diabéticos sem RD e com RDNP ligeira apresentaram menor espessura das camadas dos segmentos externos dos fotorreceptores (p<0.001) e fibras nervosas (p=0.044), e uma maior espessura da camada nuclear interna (p<0.001), com envolvimento das camadas adjacentes, observando-se um aumento de espessura das camadas plexiforme externa (p=0.002) e células ganglionares/plexiforme interna nos diabéticos com RDNP, comparativamente ao grupo controlo. Cinquenta e três por cento (53.3%) dos doentes sem RD e 58% dos diabéticos com RDNP ligeira apresentaram espessura de retina normal. Trinta por cento (30.0%) dos doentes com RDNP e 27.9% dos doentes com RDNP ligeira apresentaram espessura da retinia acima dos valores normais (>291.3µm). A espessura da camada nuclear interna parece ser a que mais contribui para esse aumento (em 78% e 92% dos doentes sem RD e com RDNP ligeira, respetivamente), verificando-se envolvimento das camadas adjacentes.Após 24 meses de seguimento, observou-se nos diabéticos sem RD uma diminuição de espessura das camadas de células ganglionares (p=0.001) e nuclear interna (p=0.013), e diminuição do tempo de latência e aumento da amplitude da onda P1 (p>0.05), comparativamente a v1. No grupo ETDRS nível 20-35 observou-se diminuição das camadas da retina, com significância estatística na camada nuclear interna (p=0.038), e diminuição da amplitude da onda P1 na área foveal (p=0.297). Os diabéticos com RDNP apresentaram maior atraso no tempo de latência da onda P1 no anel 3 (p=0.030), em relação aos diabéticos sem RD.O comprometimento neurovascular, observado neste estudo, parece estar envolvido em diferentes graus, em indivíduos diferentes, e sugere a existência de alteração da barreira hematorretiniana (BHR) e consequente acumulação de fluido extracelular na camada nuclear interna e camadas adjacentes, com perda de células ganglionares, células bipolares e fotorreceptores, o que pode contribuir para a perda de visão nestes doentes.The incidence of Diabetes Mellitus (DM) has increased in recent years, with a tendency to grow in the next decade. Its complications, micro and macrovascular, emerge as one of the greatest threats to health around the world, with great economic and social costs.Diabetic Retinopathy (DR) is one of the main complications of DM. Despite advances in diagnostic methodology that have led to a better elucidation of its pathophysiology, and in the application of new therapeutic approaches, DR remains the main cause of working-age blindness in the Western countries (2-4). DR has been classically considered as a microvascular retinal disease. However, recent evidence suggests that retinal neurodegeneration is an early event in the pathogenesis of DR and may precede the development of microvascular lesions (5-7).It is essential to understand the pathophysiology of DR, not only for the management of the disease, but also for the development of new therapeutic strategies. Retinal neurodegeneration in diabetic patients is caused by complex mechanisms, which include ocular and systemic factors causing biochemical and cellular changes in the retina.Hyperglycemia, by disrupting the delicate metabolic environment of the retina, reduces insulin receptor signals, which are essential for neuronal development, growth and survival, leading to neuronal apoptosis (8). Other molecular factors such as increased oxidative stress, inflammation, loss of neuroprotective factors and glutamate excitotoxicity also contribute to neurodegeneration (7,9-11).Spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) and multifocal electroretinography (mfERG) have been increasingly used in practice and clinical research as non-invasive and objective methods for assessing retinal structure and function. Structurally, through recent SD-OCT segmentation software, it has been possible to make a quantitative and qualitative analysis of the thickness of all layers of the retina. On the other hand, functionally, the mfERG, through the analysis of the P1 waveform (amplitude and implicit time), allows to evaluate the retinal bioelectric response in a localized way.Thus, it was intended with this work to identify retinal neurodegenerative changes in 73 diabetic patients, 30 patients without DR (ETDRS level 10) and 43 patients with mild NPDR (non-proliferative diabetic retinopathy) (ETDRS levels 20-35), using SD-OCT and mfERG during two years.In a first analysis (v1), a longer implicit time and a lower amplitude of the P1 (p<0.001) were observed in diabetic patients without DR or with mild NPDR, compared to the control group. Diabetics without DR or with mild NPDR showed thinning of the photoreceptor outer layer (p <0.001) and nerve fiber layer (p = 0.044), and thickening of the inner nuclear layer (p <0.001), with involvement of the neighbour layers, with an increase of the outer plexiform (p = 0.002) and ganglion cell/inner plexiform layers in diabetics with mild NPDR, compared to the control group. Fifty-three percent (53.3%) of patients without RD and 58% of patients with mild RDNP had normal retinal thickness. Thirty percent (30.0%) of patients without RD and 27.9% of patients with mild RDNP showed a retinal thickness above normal values (> 291.3μm).The thickness of the inner nuclear layer appears to be the most contributor to this increase (showed in 78% of patients without RD and 92% of patients with mild RDNP), and shows an involvement of the neighbour layers. After 24 months of follow-up, a decrease in the ganglion cellslayer (p=0.001) and in the inner nuclear layer (p=0.013) was observed in diabetics without DR as well as a decrease in the implicit time of P1 wave and an increase in its amplitude (p>0.05), compared to visit 1. The ETDRS level 20-35 group showed a significant decrease in the inner nuclear layer thickness (p=0.038), and a decrease of the P1 amplitude in the foveal area (p=0.297). Diabetics with mild NPDR had a higher delay in P1 implicit time in ring 3 (p = 0.030), compared to diabetics without DR.Neurovascular impairment, observed in this study, appears to occur in different degrees in different patients, suggesting that the breakdown of the blood-retinal barrier (BHR) leads to accumulation of extracellular fluid in the inner nuclear layer and surrounding layers, with consequent loss of ganglion and bipolar cells and photoreceptors, which may contribute for future visual function impairment of these patients