Heterologous expression of FtsH- m1 protease in Nicotiana tabacum L.

As proteases FtsHs, encontradas em eubactérias e eucariotos, pertencem à família das proteínas AAA (ATPases associadas a diferentes atividades celulares) e são classificadas no grupo das metaloproteases. A proteína FtsH foi primeiro identificada em Escherichia coli em mutantes ftsH (filamentation temperature sensitive) como uma protease que age facilitando a degradação de proteínas intermembrânicas e citosólicas. Ortólogas a FtsH já foram encontradas em leveduras, metazoários e plantas. Nestas últimas, a FtsH pode estar localizada nos plastídeos, como uma proteína integral da membrana dos tilacóides ou na membrana interna das mitocôndrias, como em leveduras. Estudos sobre as isoformas plastidiais são abundantes e indicam a participação dessas proteases na renovação da proteína D1, componente do fotossistema II, na resposta hipersensível e na biogênese das membranas do tilacóide. Os estudos sobre as isoformas mitocôndriais são escassos e resumem-se a informações sobre o direcionamento subcelular dessas proteases e evidências de seu envolvimento no acúmulo da subunidade 9 da ATP-sintase na membrana interna. Com o objetivo de caracterizar a função da FtsH-m1 em plantas, foi realizada a transformação genética de Nicotiana tabacum via Agrobacterium tumefaciens contendo um plasmídeo em que o cDNA da FtsHm1 de cana-de-açúcar encontra-se sob o controle de um promotor transcricional constitutivo. Esse plasmídeo apresenta o gene seletivo nptII, que confere resistência à canamicina. As plantas regeneradas in vitro, 17 no total, foram aclimatadas e transferidas para a casa de vegetação até a produção de sementes. As plantas regeneradas foram testadas quanto à presença do cDNA da FtsH-m1 de cana-de-açúcar por meio da técnica de PCR. A seleção de plantas da geração T1 que possuíam o transgene de interesse foi conduzida em ensaios in vitro e em casa de vegetação baseados na resistência dessas plantas à canamicina. A presença do transgene foi confirmada por meio da técnica de PCR. A análise da expressão heteróloga foi realizada via RT-PCR e revelou níveis elevados de RNA mensageiro nas plantas transformadas. Ao todo, foram obtidas dez plantas de fumo em que a presença do transgene de interesse foi confirmada. Não foram observadas alterações fenotípicas marcantes nas plantas das gerações T0 e T1 que pudessem ser relacionadas à expressão heteróloga da FtsH-m1 de cana-de-açúcar. Devem ser realizadas análises mais finas, que podem incluir ensaios para a investigação de possíveis alterações na função mitocondrial, no metabolismo respiratório ou na ultraestrutura das mitocôndrias em plantas a partir da geração T2.FtsH proteases of eubacteria and eucaryotes belong to the AAA protein family (ATPases associated with different celular activities) and are included among the metaloproteases. The FtsH protein was first described in ftsh (filamentation temperature sensitive) mutant of Escherichia coli as a protease involved in the degradation of transmembrane and cytosolic proteins. FtsH-ortologous proteins have been described in yeast, metazoa and plants. In the latter, FtsHs are localized to plastids, as an integral membrane protein of thylakoid or, as in yeast, to the inner mitochondrial membrane. The various studies on the plastid isoforms point to their involvement in the turnover of D1 protein, a member of the photosystem II, in hypersensitive response, and in thylakoid membrane biogenesis. On the other hand, data on the mitochondrial isoforms are scarce and restricted to their subcellular localization, and involvement in the accumulation of ATP-synthase subunit 9 in the inner membrane. With the aim of disclosing the function of FtsH-m1 in plants, Nicotiana tabacum plants were transformed by Agrobacterium tumefaciens carrying a designed plasmid containing the sugar-cane FtsH-m1 cDNA under the control of a constitutive-transcription promoter. This plasmid also contained the selectable kanamycin-resistance gene nptII. The seventeen plants obtained in vitro were acclimatized and kept in a greenhouse until seeding. These plants were then tested by PCR for the presence of the sugar-cane FtsH-m1 cDNA. Selection of T1 plants for the presence of the transgene of interest was carried out both in vitro and in the greenhouse, based on kanamycin resistance. The transgene carrier status of the selected plants was confirmed by PCR. Higher levels of FtsH-m1 messenger RNA were detected by RT-PCR in transformed T1 plants. A total of ten tobacco plants carrying the sugar-cane FtsH-m1 cDNA were obtained. T0 and T1 plants did not show conspicuous phenotype alterations which could be related to the heterologous gene expression. Refined analyses are needed in plants from T2 generation on, including the evaluation of mitochondrial structural abnormalities and disfunction, as well as respiratory alterations