Metabolization of xenobiotics and bioinsecticide production by insect-associated bacteria

Os insetos são o grupo de organismos multicelulares mais abundantes e diversos, habitando os mais variados ambientes. Muitas de suas adaptações a condições adversas podem estar relacionadas à sua associação a bactérias. O conhecimento da diversidade dessa associação pode elucidar a importância desses microrganismos nas respostas de insetos a fatores bióticos e abióticos. Bactérias também são o principal alvo de exploração para o desenvolvimento de produtos de interesse biotecnológico. Dada à sua diversidade e interações com o ambiente, insetos representam um novo nicho para a exploração de microrganismos com potencial biotecnológico. A longa história de associação dos insetos com bactérias e os dados recentes da participação da microbiota a eles associada na degradação de moléculas orgânicas, naturais e/ou sintéticas, indicam o potencial desses microrganismos de interferir na resposta do inseto a inseticidas. Adicionalmente, simbiontes bacterianos associados aos insetos também podem ser uma fonte promissora de compostos bioativos. A descoberta de novos compostos naturais vem decaindo, surgindo a necessidade de exploração de novos nichos de microrganismos e o uso de novas tecnologias para superar o número reduzido de novas moléculas identificadas. Assim, este trabalho buscou explorar simbiontes de insetos para o estudo da sua participação na metabolização de xenobióticos pelo hospedeiro e a identificação de novos compostos inseticidas, tendo como objetivos investigar i) os mecanismos envolvidos na degradação de inseticidas e sua contribuição na capacidade de sobrevivência do hospedeiro, e ii) a diversidade biológica na busca de novas moléculas inseticidas. Bactérias com potencial de degradação de xenobióticos isoladas da microbiota intestinal de insetos resistentes a inseticidas foram utilizadas para a colonização do trato intestinal de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae) suscetível à inseticidas e investigação da sua participação na sobrevivência do hospedeiro quando exposto a inseticidas, assim como a existência de custo adaptativo da associação a bactérias com capacidade de metabolização de inseticidas. O isolado IIL-Cl29 Leclercia adecarboxylata foi capaz de contribuir para a sobrevivência de lagartas expostas a chlorpyrifos ethyl, passando a exigir uma CL50 cerca de 2 vezes superior àquela de lagartas apossimbiontes. Estudo de biologia comparada entre a linhagem apossimbionte e aquela associadas ao isolado IIL-Cl29 demonstrou a existência de custo adaptativo para essa associação, quando na ausência da pressão de seleção do inseticida. A investigação dos mecanismos envolvidos na metabolização de inseticidas por bactérias simbiontes de S. frugiperda resistente ao organofosforado chlorpirifos ethyl, aos piretroides lambda-cyhalothrin e deltamethrin, a espinosina spinosad e a benzoilureia lufenuron revelou, por meio de análises químicas, que essas bactérias são capazes de metabolizar e bioacumular inseticidas interferindo ativamente na atividade de xenobióticos no hospedeiro. O isolado IIL-Luf14 Microbacterium arborescens foi selecionado para a realização de estudos mais aprofundados para a identificação de produtos de degradação e comprovação do mecanismo de bioacumulação de lufenuron. O potencial de simbiontes de insetos para o isolamento de bioinseticidas foi avaliado em estudos da diversidade de bactérias cultiváveis associadas a Acromyrmex coronatus (Fabricius, 1804) (Hymenoptera: Formicidae). Foram identificados 46 isolados pertencentes a Actinobacteria, Firmicutes e Proteobacteria associados a essa formiga e estudos da atividade inseticida in vivo e in vitro de extratos orgânicos de metabólitos mostraram grande variação nos resultados de atividade. Ensaios in vivo com lagartas de 1º instar de S. frugiperda mostraram-se mais adequados, e o isolado Asp77 Streptomyces drozdowiczii foi selecionado para a identificação de moléculas ativas com efeito inseticida. Dois compostos bioativos com atividade inseticida foram identificados e a atividade inseticida atribuída para duas classes químicas diferentes: um composto pirrolobenzodiazepino e um alcaloide. Nossos resultados comprovam a hipótese de que simbiontes participam da metabolização de xenobióticos em insetos, ao mesmo tempo que possuem potencial para exploração de novos compostos inseticidas.The insects are the most diverse and abundant group of multicellular organisms, inhabiting a range of environments. Many of their adaptations to restricting conditions are related to their association with bacteria. The knowledge of the diversity of insect associations with bacteria can elucidate their role in insect response to biotic and abiotic factors. Bacteria are also the main target of exploitation for the development of biotechnological products. Insect´s diversity and interactions with the environment turn insects a new niche for the exploration of microorganisms with biotechnological potential. The long history of association of insects with bacteria and the participation of insect-associated bacteria in the degradation of natural and/or synthetic organic molecules indicate the potential of these microorganisms to interfere with insect response to insecticides. Additionally, bacterial symbionts associated with insects may also be a promising source of bioactive compounds. The discovery of new natural compounds has been declining, requiring the exploration of new niches of microorganisms and the use of new technologies to overcome the reduced number of molecules discovered. This work aimed to investigate the role of insect-associated bacteria in the metabolism of xenobiotics in the host and their potential to synthesize insecticidal compounds. Our objectives were to demonstrate i) the mechanisms involved in insecticide degradation by selected microbial symbionts, and to determine their contribution to host survival when exposed to insecticides, and ii) the biological and metabolic diversity of the microbiota associated with a leaf cutting ant. Bacteria that are able to degrade xenobiotics isolated from the gut microbiota of insecticide-resistant insects were used for the colonization of the gut of a susceptible strain of Spodoptera frugiperda (JE Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae). Comparisons of larval survival after insecticide exposure and the existence of adaptive costs of the association were done by using a aposymbiotic and infected susceptible lines. Suceptible larvae infected with IIL-Cl29 Leclercia adecarboxylata require twice the dose of chlorpyrifos ethyl to kill 50% of the larave (LC50) when compared to the aposymbiotic larvae. But the association with IIL-Cl29 was shown costly to S. frugiperda, particularly affecting female fecundity. However, no fitness costs were detected to infected larvae in the presence of the selection pressure (insecticide). GC-MS and LC-MS-MS analyses of the bacteria isolated from resistant larvae of S. frugiperda to organophosphate (chlorpirifos ethyl), pyrethroid (lambda-cyhalothrin and deltamethrin), spinosyn (spinosad) and benzoylurea (lufenuron) revealed they are able to hydrolyze, metabolyze and bioaccumulate insecticides, showing they can actively interfere with the efficacy of insecticides against the host. These processes were better characterized for the isolate IIL-Luf14 Microbacterium arborescens. The species and metabolic diversity of culturable bacteria associated with Acromyrmex coronatus (Fabricius, 1804) (Hymenoptera: Formicidae) were investigated to demonstrated their potential to produce bioinsecticides. A total of 46 isolates belonging to Actinobacteria, Firmicutes and Proteobacteria were identified. In vivo and in vitro assays to detect insecticide activity in organic extracts of fermentates indicated a great number of active extracts. In vivo assays with 1st instars of S. frugiperda were more adequate in detecting toxic molecules to insects, and the isolate Asp77 Streptomyces drozdowiczii was selected for the identification of active molecules with insecticidal effect. Two bioactive compounds with insecticidal activity were identified and the insecticidal activity attributed to two different chemical classes: pyrrolobenzodiazepine and alkaloid. Our results support the hypothesis that symbionts participate in the metabolization of xenobiotics in insects, at the same time that they have potential for exploration of new insecticides