Mechanisms of prostate cancer radiotherapy resistance

Prostatakrebs (PCa) ist eine der häufigsten, männlichen Krebserkrankungen. Eine Behandlungsmethode, welche in allen Krankheitsstadien angewendet wird, ist die Strahlentherapie (RT). Ein Rückfall des PCa nach angewandter RT ist häufig und kann nach neuesten Erkenntnissen von sogenannten Krebsstammzellen (CSCs) vermittelt werden. In der Prostata befinden sich gewebe-spezifische Stammzellen in der Basalzellschicht. Das Ziel der ersten Studie war es, den Effekt von fraktionierter Bestrahlung (FR) (nach einem therapiegetreuen Behandlungsplan) auf das Transkriptom von primären, basalen Prostatazellen (PrEPs) zu untersuchen. Nach der Isolierung der PrEPs wurden diese mit FR behandelt, das Gesamt-Transkriptom sequenziert und eine bioinformatische Analyse durchgeführt. Im Anschluss konnten wir mittels Gen-anreicherungs-Analyse (GSEA) die Herabregulation von 77 Interferon (IFN) Typ I-regulierten Genen auf mRNA-Ebene in den mit FR behandelten PrEPs feststellen. Darunter befanden sich 20 von 27 Gen-Transkripten einer kürzlich veröffentlichten IFN-Stammzell-Down Signatur (ISDS). Des Weiteren konnten wir eine negative Anreicherung von Zellzyklus-Checkpoint (CP) Genen nach der FR demonstrieren. Da IFNs eine Schlüsselrolle in der Effektivität der RT spielen, indem sie das Immunsystem bei der Erkennung und Eliminierung von Zellen mit DNA Schäden unterstützen, könnte dies ein Mechanismus zur Umgehung der Immunantwort nach der FR der PrEPs sein. Des Weiteren könnten herabregulierte CP Gene ein Mechanismus zur Umgehung des durch den Zell-Zyklus Arrest verursachten Zelltodes sein. Dies könnte zur Anhäufung chromosomaler Anomalien führen, was wir als möglichen Mechanismus einer RT-induzierten Bildung von bösartigen Zellen interpretieren. Beide Erkenntnisse könnten des Weiteren Indizien für eine FR-bedingte Selektion von Zellen mit stammzell-ähnlichen Eigenschaften sein. Jedoch müssten weitere, funktionelle Studien aufklären, ob FR zur Selektion von stammzell-ähnlichen Zellen führt. Zusammenfassend konnten wir zwei neue Mechanismen, mit dem Potential Strahlenresistenz zu verursachen, aufdecken. BRCA Proteine spielen eine wichtige Rolle in der Reparatur von DNA Doppelstrangbrüchen (DSBs) durch homologe Rekombination. In Krebserkrankungen (Eierstock, Gebärmutter und PCa) sind deren Gene häufig mutiert. Poly(ADP-ribose)-Polymerase (PARP) Inhibitoren (PARPis), wie Olaparib, inhibieren die Reparatur von DNA Einzelstrangbrüchen (SSBs), welche in Folge zu DSBs werden und von Zellen mit defekten BRCA nicht mehr repariert werden können (synthetische Letalität). Studien konnten einen vorteilhaften Effekt von PARPis in Kombination mit etablierten Therapiekonzepten zeigen. In der zweiten Studie untersuchten wir den Effekt von Olaparib in Kombination mit Androgendeprivationstherapie (ADT). Wir behandelten PCa Zelllinien in 2D- und 3D-Zellkulturen mit Olaparib allein, oder mit vorhergehender bzw. paralleler ADT. Die PCa Zelllinie LNCaP, welche BRCA2 Mutationen aufweist, reagierte sensitiv auf die Inhibition von PARP durch Olaparib. Zelllinien mit der TMPRSS2:ERG Fusion (VCaP, DuCaP) reagierten, zwar nicht durch synthetische Letalität, aber sehr wahrscheinlich durch zytotoxische Effekte sensitiv. Auch nach ADT reagierten die Zelllinien sensitiv auf Olaparib, was auf seine potentielle Rolle in der Erhaltungstherapie für PCa Patienten hinweist. Wir denken, dass Olaparib, besonders im Sinne der personalisierten Krebsmedizin (z.B. für Patienten mit BRCA Mutationen), eine tragende Rolle spielen könnte. Zytokine beeinflussen zelluläre Ereignisse wie Proliferation, Migration und Invasion im PCa. Der CD44 Rezeptor ist ein Prostata Basalzell-Marker, welcher vom Interleukin 4 (IL-4)-STAT6 Signalweg reguliert wird. Studien weisen darauf hin, dass es eine Basalzell-ähnliche Subpopulation (CD44high/CD49bhigh) gibt, welche Tumor-initiierende Charakteristika aufweist. In einer dritten Studie untersuchten wir den Effekt einer Langzeitbehandlung der PCa Zelllinie PC3 mit IL-4. Diese resultierte in einer erhöhten Anzahl an CD44high-Zellen mit veränderter Morphologie. Mittels Durchflusszytometrie konnte gezeigt werden, dass die CD44high-Population auch hohe Levels an CD49b exprimiert. Nach Anreicherung dieser Population (Fluoreszenz-basierende Zellsortierung) konnten außerdem erhöhtes migratives, proliferatives und Kolonie-bildendes Verhalten, im Vergleich zur CD44low/CD49blow-Population, nachgewiesen werden. Wir schlussfolgern, dass die IL-4 Langzeitbehandlung eine Subpopulation mit Tumor-initiierenden und Basalzell-ähnlichen Charakteristika induziert, und dass der IL-4 Signalweg einen Angriffsmechanismus für zukünftige Therapiekonzepte darstellt.Prostate cancer (PCa) is one of the most frequent cancers in males. Radiation therapy (RT) is a treatment option for all stages of PCa. Recent studies indicate that PCa relapse after RT, which is a frequent event, could be mediated by cancer stem cells (CSCs). Within the prostate, tissue-specific stem cells can be found in the basal layer. The aim of the first study of this thesis was to determine the effect of fractionated radiation (FR) (following a therapeutic schedule) on the transcriptome of primary prostate basal cells (PrEPs). Therefore, PrEPs were isolated and treated with FR. Next, whole transcriptome sequencing and bioinformatical analysis were performed. By using gene-enrichment analysis (GSEA) after transcriptome sequencing we could demonstrate the downregulation of 77 interferon (IFN) type I-regulated genes at mRNA level after FR, including 20/27 transcripts of a recently published IFN-Stem Cell-Down signature (ISDS). Furthermore, we observed a negative enrichment of cell cycle checkpoint (CP) genes after FR. Since IFN signalling plays a crucial role in the effectiveness of RT by supporting the immune system to recognise and eliminate cells with DNA damage, we conclude that this could represent a potential mechanism of PrEPs to evade the immune response subsequent FR. Moreover, the downregulation of CP genes could be a mechanism of evasion from cell cycle arrest-mediated cell death. This could lead to the accumulation of chromosomal aberrations and thus could contribute to the FR-induced development of malignant cells. Both results could furthermore indicate a FR-induced selection for stem cell-like cells. However, further functional studies are needed to confirm whether FR selects for stem-like cells. In summary, we were able to describe two novel molecular mechanisms with the potential of mediating radio-resistance. BRCA genes are frequently mutated in ovarian, breast and PCa. Their corresponding proteins play an important role in DNA double-strand break (DSB) repair via homologous recombination. Poly(ADP-ribose)-polymerase (PARP) inhibitors (PARPis), such as olaparib, inhibit the repair of DNA single-strand breaks (SSBs), leading to the formation of DSBs which cannot be repaired by BRCA deficient cells (synthetic lethality). Several studies reported on beneficial effects of PARPi treatment when combined with established therapies. In the second pre-clinical study, we determined the effect of olaparib in combination with androgen deprivation therapy (ADT). We administered olaparib as single treatment, subsequent ADT or in combination with ADT to 2D and 3D PCa cell cultures models. LNCaP PCa cells, which carry BRCA2 mutations, were sensitive to olaparib single treatment. We furthermore observed that TMPRSS2:ERG fusion positive PCa cell lines (VCaP, DuCaP) are also sensitive to olaparib, however, more likely because of cytotoxic effects, rather than by synthetic lethality. Finally, PCa cell lines were still sensitive to olaparib after ADT, promising its potential role as maintenance therapy in the future of personalised PCa treatment, especially in patients with BRCA mutations. Cytokines can influence cellular processes such as proliferation, migration and invasion in PCa. CD44, which is a prostate basal cell marker, is regulated by the interleukin 4 (IL-4)-STAT6 signalling pathway. Studies indicate that there is a basal-like subpopulation (CD44high/CD49bhigh) with tumour-initiating properties. In the third study, we examined the effect of long-term IL-4 treatment of PC3 PCa cells. Long-term IL-4 treatment resulted in elevated expression of CD44 and morphologically changed cells. By using flow cytometry, we could demonstrate that the CD44high-expressing population corresponds to the CD49bhigh-population. Isolation of this subpopulation by fluorescence-associated cell sorting revealed elevated proliferation, migration and clonogenic potential in comparison to the CD44low/CD49blow-population. We conclude that IL-4 long-term treatment induces a PC3 subpopulation with tumour-initiating and basal-like qualities, suggesting that the IL-4 pathway is a potential target for future PCa treatment regimens.submitted by Fabian Guggenberger, BSc, MScZusammenfassung in deutscher SpracheKumulative Dissertation aus drei ArtikelnMedical University of Innsbruck, Dissertation, 2018OeBB(VLID)280249