Molecular mechanism of ESCRT membrane protein degradation and consequences of failure : recruitment dynamics of ESCRT-III and Vps4 to endosomes and implications for reverse membrane budding

Die ESCRT (endosomal sorting complexes required for transport) Maschinerie ist eine wesentliche Komponente zur Modellierung von Biomembranen und für die Abschnürung von zellulären Vesikeln. Es handelt sich um eine Multiprotein-Maschinerie, die unter anderem von ubiquitinierten Cargo-Proteinen an Endosomen rekrutiert wird und dort zur Bildung von itraluminalen Vesikeln (ILV) und somit zur Biogenese von mulivesikulären Körpern (multivesicular body, MVB) benötigt wird. Aktuelle Modelle postulieren eine schrittweise Rekrutierung der einzelnen Proteinuntereinheiten. Dieser sequenzielle Aufbau der Maschinerie gipfelt in der Rekrutierung einer AAA-ATPase, Vps4. Dies ist die einzige ATP abhängige Komponente und verantwortlich für die Disassemblierung der Maschinerie und das Recycling der Proteinuntereinheiten. Diese Modelle basieren auf genetischen und biochemischen Rekonstitutions-Experimenten. In der vorgelegten Arbeit beschreiben wir zum ersten Mal in vivo die Dynamik der ESCRT Untereinheiten an Endosomen im Modellorganismus Hefe (Saccharomyces cerevisiae). Wir haben dafür funktionale, Fluoreszenz markierte ESCRT-III und Vps4 Untereinheiten kloniert, die anschließend in vivo und mit Hilfe von 3D lattice-light-sheet Mikrokopie (LLSM) und hochauflösender, korrelierter Fluoreszenz- und Elektronen-Mikroskopie (correlative light and electron microscopy, CLEM) untersucht wurden. Die Daten, die wir aus diesen Experimenten gewonnen haben, sind nicht mehr mit den aktuellen Modellen zu erklären. Unsere Messungen ergaben, dass ESCRT-III Untereinheiten (60 150 Snf7 und 14 30 Vps24 Moleküle) gleichzeitig mit 4 (oder mehr) Vps4 Hexameren rekrutiert werden. Die Lebensdauer, der ESCRT-III und Vps4 Komplexe am Endosom beträgt 3 45 sec. Fluktuationen in der Anzahl der Untereinheiten deuten auf einen andauernden und stochastischen Austausch der ESCRT-III und Vps4 Untereinheiten, anstatt eines sequenziellen Zusammenbaus der ESCRT Maschinerie hin. Intraluminale Vesikel werden gebildet, sobald 4 oder mehr Vps4 Hexamere rekrutiert werden. Basierend auf unseren Daten, schlagen wir daher ein neues Modell vor, bei dem ubiquitinierte Cargo-Proteine an Endosomen die Rekrutierung der ESCRT Proteine einleiten. Mehrere ESCRT-III Filamente und Vps4 Hexamere tragen zusammen mit dem Cargo dazu bei, dass die endosomale Membran eingestülpt und die Cargo-Proteine in einem intraluminalen Vesikel abgeschnürt werden.The endosomal sorting complexes required for transport (ESCRT) mediate reverse membrane remodeling and scission. This multisubunit machinery is recruited to endosomes, mediating intraluminal vesicle (ILV) formation during multivesicular body (MVB) biogenesis in eukaryotic cells. Current models suggest a gradual / sequential recruitment of ESCRT subunits, into a membrane deformation machinery. This process is terminated by a burst of the AAA-ATPase Vps4, the only thermodynamic driving force and final disassembling factor. These models base on genetic and in vitro reconstitution experiments. We describe for the first time the recruitment dynamics of endogenous ESCRT-III and Vps4 on endosomes in yeast cells (Saccharomyces cerevisiae). Our data, obtained by 3D lattice light sheet microscopy (3D LLSM), high-resolution correlative light and electron microscopy (CLEM) and acute depletion of fluorescently labelled ESCRT subunits, are not consistent with the sequential recruitment of ESCRT-III and Vps4. Based on the results we obtained, we suggest a scenario, where ESCRT-III subunits (60 150 Snf7 and 14 30 Vps24 molecules) polymerize rapidly on endosomes together with 4 (or more) Vps4 hexamers. The assemblies have a lifetime of 3 45 sec with a continuous and stochastic exchange of ESCRT-III components and Vps4, rather than a steady growth of fixed assemblies, dependent on Vps4 ATPase activity. We found a signature for “productive” assemblies, which recruit at least 4 Vps4 hexamers, and “non-productive” assemblies. The later are events, where ESCRT-III components fail to recruit more than 4 Vps4 hexamers and therefore cannot complete ILV formation. From these observations we reason that multiple Vps4 hexamers constrict several ESCRT-III filaments to first deform the membrane in response to cargo crowding. This generates the neck of a nascent ILV bud, leading to membrane constriction and ultimately to vesicle fission and release.vorgelegt von Simona Maria MiglianoZusammenfassung in deutscher SpracheMedical University Innsbruck, Dissertation, 2017OeBB(VLID)221373