Metallothionein expression in helicid snails : molecular specificity versus physiological plasticity

Landschnecken aus der Familie der Helicidae, wie die heimische Weinbergschnecke Helix pomatia oder die gefleckte Weinbergschnecke Cantareus aspersus haben sich hervorragend an die zum Teil harschen, stark wechselnden Bedingungen ihres natürlichen terrestrischen Habitats angepasst. Um das Überleben zu sichern sind unter anderem eine Regulation der Metallhomöostase und Detoxifikation sowie eine effektive Reaktion auf diverse Stressoren von Nöten, zum Beispiel anhand der Expression von Metallothioneinen (MTs). Dies sind multifunktionale, niedermolekulare Proteine, die in verschiedenste Vorgänge innerhalb des Organismus wie etwa Metallregulation und Entgiftung, Stressantwort, Zelldifferenzierung und Entwicklung involviert sind. In heliciden Schnecken binden zwei der drei MT-Isoformen Metalle selektiv und können daher folgendermaßen unterschieden werden: das Cadmium-MT (CdMT) bindet vorwiegend Cd2+ und ist hauptsächlich an der Entgiftung von Cd2+ beteiligt. Das Kupfer-MT (CuMT) hingegen bindet monovalente Cu+ Ionen mit hoher Spezifität und übernimmt eine wichtige Funktion in der Metalhomöostase und der Synthese von Hämocyanin, dem Kupfer-haltigen Blutfarbstoff der Mollusken. Eine dritte, jedoch unspezifische Isoform (Cd/CuMT), ist in der Lage, sowohl Cd2+, als auch Cu+ Ionen zu binden und wurde erstmals in Cantareus aspersus charakterisiert. Hohe mRNA-Konzentrationen dieser intermediären Isoform in Embryos von Cantareus aspersus deuten auf eine wichtige Funktion in der Embryonal- Entwicklung hin. Für Helix pomatia hingegen waren bisher weder Daten zur Cd/CuMT-Expression vorhanden, noch liegt bislang eine vollständige mRNA-Sequenz der Cd/CuMT-Isoform vor. Bei Vertebraten gut untersucht ist die metall-induzierte Aufregulierung der MT-mRNA-Expression durch Bindung des Transkriptionsfaktors MTF-1 (Metal response element-binding transcription factor an sogenannte Metal Responsive Elements (MREs) in der Promotor-Region von MT-Genen. Experimentell ist dieses Aktivierungs-Modell bisher jedoch fast ausschließlich aus Studien mit Vertebraten und einigen Modellorganismen bestätigt worden. Funktionelle Studien zur Aktivierung des MT-Promotors von Gastropoden sind noch ausständig. Der Promotor des CdMT-Gens der heimischen Weinbergschnecke zum Beispiel enthält vier MRE-Bindungsstellen (MREa, MREb/c und MREd). Ob jedoch ein Transkriptionsfaktor daran bindet und um welchen es sich hierbei handelt, ist bislang nicht bekannt. Ziel dieser Arbeit war es daher, den Einfluss von metallischen und nicht-metallischen Stressoren auf die CdMT-Genexpression bei der Weinbergschnecke zu analysieren. Dazu wurde insbesondere die Rolle der MREs im CdMT-Promoter von Helix pomatia bei Kontrolltieren und Cd-exponierten Individuen untersucht. Darüber hinaus wurde erstmalig die Genexpression aller drei MT-Isoformen sowohl in unbelasteten als auch in Cd- und Cu-belasteten Embryos von Helix pomatia gemessen. Schließlich wurde die bislang nur für die codierende Region vorliegende mRNA-Sequenz der Cd/CuMT-Isoform in der heimischen Weinbergschnecke vervollständigt und analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass die Transkription des CdMT-Gens der Weinbergschnecke am stärksten durch Cd-Belastung aufreguliert wird, während physiologische Stressoren wie Austrocknung oder Sauerstoffmangel die CdMT-Genexpression nur geringfügig (Austrocknung) oder gar nicht (Sauerstoffmangel) erhöhen. Darüber hinaus zeigte sich, dass sowohl die Aktivität der einzelnen Individuen als auch deren Biorhythmus im Tagesverlauf zu einer erhöhten Variabilität der mRNA-Konzentration des CdMT-Gens innerhalb der Versuchsgruppen führen. Dies spiegelte sich auch in den Protein-Bindungsstudien des CdMT Promoters von Helix pomatia mittels DNase I Footprinting und EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay) wieder, wo sich eine hohe Variabilität der Footprinting-Muster auch innerhalb der einzelnen Versuchsgruppen (Kontrolltiere und Cd-exponierte Schnecken) zeigte. Anhand dieser Experimente konnte zwar eine Proteinbindung an alle vier MREs des CdMT-Gens von Helix pomatia nachwgewiesen werden, wobei sich insbesondere für das MREb/c eine vorwiegend unter Cd-Belastung auftretende Bindungsaktivität zeigte. Insgesamt jedoch bleibt die Spezifität und Bedeutung der MREs für die Cd-abhängige Aufregulierung des CdMT-Gens weiterhin fraglich. Dies insbesondere deshalb, weil bislang kein überzeugender Bindungs-Kandidat ausgemacht werden konnte, der dabei als Transkriptionsfaktor in Frage käme. In Embryos von Helix pomatia wird Cd2+ bereits in einer sehr frühen Phase der Embryonalentwicklung entgiftet. Demgegenüber konnte für das CuMT-Gen erst in einem etwas fortgeschrittenen Embryonalalter (mehr als 7 Tage nach der Befruchtung) eine Transkription auf niederem Niveau beobachtet werden. Auch konnte keine Induktion der Expression des CuMT-Gens durch Metallbelastung (Cd oder Cu) festgestellt werden. Die weitaus höchste Aufregulation unter allen drei MT-Genen in embryonalen Schnecken erfolgte für das Cd/CuMT-Gen, das bereits in der Frühphase der Embryonalentwicklung (7 und 20 Tage nach der Befruchtung) stark exprimiert wird und zudem in 20 Tage alten Schnecken durch Exposition an Cu2+ aufreguliert wird. Ähnliche Ergebnisse fanden sich in Embryonen der nahverwandten Art Cantareus aspersus. Dies legt nahe, dass diese intermediäre Cd/CuMT-Isoform wahrscheinlich eine wichtige Rolle in der Embryonal- Entwicklung helicider Schnecken spielt. Ein gravierender Unterschied konnte jedoch in der Cd/CuMT-Expression zwischen adulten Schnecken von Helix pomatia und Cantareus aspersus festgestellt werden. Während in Cantareus aspersus das Cd/CuMT in der Mitteldarmdrüse sowohl auf transkriptionaler als auch translationaler Ebene exprimiert wird, konnte in vergleichbaren Proben von Helix pomatia kein Cd/CuMT-Protein nachgewiesen werden, obwohl mRNA-Transkripte dieser MT-Isoform vorhanden waren. Vergleicht man nun die 3untranslated regions (3UTRs) der jeweiligen mRNAs von Helix pomatia und Cantareus aspersus miteinander, so fällt auf, dass die 3UTR von Helix pomatia doppelt so lang ist als jene der nahe verwandten Art. Eine genaue Analyse ergibt, dass dieser Sequenzbereich zahlreiche potentielle Bindungsstellen für RNA-Bindungsproteine enthält, die dafür bekannt sind, den Translationsprozess zu hemmen und die mRNA-Akkumulation zu fördern. Dies legt nahe, dass die Cd/CuMT- mRNA von Helix pomatia den Translationsprozess des entsprechenden Gens hemmt und somit eine regulatorische Funktion innerhalb der Zelle übernimmt. Alle MT Expressionsdaten in Kombination mit mRNA Sequenzanalysen deuten darauf hin, dass die mRNAs der drei MT Isoformen unterschiedlich lange stabil sind, wobei offenbar die mRNA des CuMT-Gens die stabilste, jene des CdMT-Gens hingegen die instabilste mRNA-Variante zu sein scheint.Terrestrial helicid snails have successfully adapted to strongly fluctuating environmental conditions in their terrestrial habitats. The ability of metal regulation and an effective stress defense strategy e.g. by the expression of Metallothioneins (MTs) are essential for the survival of these species. MTs are multifunctional, low molecular weight, cysteine rich proteins involved in many biological tasks such as metal homeostasis and detoxification, stress response, cell differentiation and development. In helicid snails two metal-specific MT isoforms evolved from a metal-unspecific MT precursor. A Cadmium-selective isoform (CdMT), predominantly binding Cd2+, is mainly involved in Cd2+ detoxification and stress response. In contrary, a Copper-selective isoform (CuMT) binds Cu+ with high selectivity and plays a crucial role in metal homeostasis and hemocyanin synthesis. A third, non-metal-specific isoform, able of binding both metal ions and called Cd/CuMT, was first characterized in the garden snail Cantareus aspersus. In embryonic individuals of this species, high mRNA concentrations of the Cd/CuMT gene were detected, suggesting an important role of this isoform in embryonic development. However, full characterization of the Cd/CuMT mRNA or expression data of this isoform were still missing in Helix pomatia. In vertebrates and some invertebrate model organisms, the upregulation of MT gene transcription is mediated by the binding of the Metal response element-binding transcription factor 1 (MTF-1) to the so-called Metal responsive elements (MREs) in the promoter region of the respective MT genes. Corresponding data for gastropod species, however, were so far still lacking. In the CdMT promoter region of Helix pomatia four MREs were identified (MREa, MREb/c and MREd) but their functionality was not proven yet. One of the aims of this study was, therefore, to evaluate the potential impact of metallic and non-metal stressors on the expression of the CdMT gene in Helix pomatia, and to test the functionality of the MRE binding sites within the CdMT promoter and their potential role in Cd-dependent upregulation of the CdMT gene. In addition, the transcriptional activity of all three MT genes was quantified in unexposed and metal-exposed (Cd, Cu) embryonic Roman snails for the first time. Last but not least, the Cd/CuMT mRNA of Helix pomatia was fully characterized. It appeared that Cd exposure was the most potent stressor for CdMT gene upregulation in Helix pomatia, whereas desiccation stress did only slightly increase the CdMT mRNA expression. No effect on the upregulation of this gene was observed upon oxygen depletion. In addition, our results have shown a large degree of individual variability of CdMT gene expression in helicid snails, which could be attributed to diurnal rhythmicity of animals and their strongly fluctuating individual activity. A high degree of variability within experimental groups (controls and Cd-exposed) was also apparent in DNase I footprinting patterns of the promoter region of the CdMT gene from Helix pomatia. Even though all four MREs of the CdMT gene showed signals of protein binding by DNase I footprinting or EMSA, a predominant Cd-dependent pattern was only observed for MREb/c. Overall, however, our results indicate that the MRE binding sites may only to a minor extent function in metal-related CdMT upregulation. Interestingly, the CdMT gene in Roman snail eggs was upregulated upon Cd2+ exposure at an already early stage of embryonic development (7 days post fertilization), indicating that in snail embryos, Cd2+ detoxification starts to work from the first days of development. In contrast, the transcription of the CuMT gene in snail embryos was significantly delayed, starting only after 7 days post fertilization. Overall, the level of the CuMT transcription in snail eggs remained rather low and was not upregulated at all by metal stress (Cd or Cu). From all three MT genes of the snail, the Cd/CuMT gene clearly showed the highest mRNA expression levels in both, 7 and 20 days old Helix pomatia embryos, and a distinct response to Cu exposure in 20 days old eggs. This is in accordance with similar results obtained from Cantareus aspersus supporting the hypothesis, that the Cd/CuMT isoform gene may play an important role in embryonic development of helicid snails. Interestingly, however, there was a distinct difference between adult individuals of Helix pomatia and Cantareus aspersus in the expression of the Cd/CuMT isoform at the protein level. Whereas the Cd/CuMT gene is expressed at both, the transcriptional and translational level in the midgut gland of adult Cantareus aspersus, no Cd/CuMT protein could be detected in the midgut gland of Helix pomatia, even though Cd/CuMT mRNA expression was present. In fact, the 3untranslated region of the Helix pomatia Cd/CuMT mRNA is markedly longer compared to that of its near relative, Cantareus aspersus. The Cd/CuMT mRNA of the Roman snail features, in contrast to its counterpart form Cantareus aspersus, a number of potential binding sites for mRNA binding proteins known to be involved in translational inhibition and mRNA transcript accumulation, indicating that the Cd/CuMT mRNA could also play a regulatory role, rather than being only a template for protein synthesis. In general, mRNA and protein expression data in combination with mRNA sequence analysis of the three different MT isoforms indicate, that the CuMT mRNA is the most stable one, followed by the Cd/CuMT and the CdMT mRNA.von Mag. Veronika Pedrini-MarthaKumulative Dissertation aus drei ArtikelnAbweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des VerfassersZFP236350Universität Innsbruck, Dissertation, 2017(VLID)172962