Chemically modified nucleic acids : synthesis of diastereomerically pure methylphosphonate-modified RNA to elucidate the function of a ribosomal RNA phosphate during EF-G triggered GTP hydrolysis

Hauptziel der vorliegenden Dissertation war es, die mechanistische Rolle des Rückgratphosphats eines spezifischen Nukleotids (A2662) der ribosomalen RNA (rRNA) bei der ribosomalen Translokation aufzuklären. Dieser Prozess wird durch den Elongationsfaktor G (EF G) maßgeblich gesteuert. Die dafür notwendige EF-G-katalysierte Hydrolyse von Guanosintriphosphat (GTP) gilt als Schlüsselreaktion im ribosomalen Elongationszyklus. Kürzlich bestimmte Kristallstrukturen von Ribosomen in Komplexen mit G-Proteinen, wie zum Beispiel den Elongationsfaktoren EF-G oder EF-Tu, sowie diverse biochemische Untersuchen, lieferten Hinweise, dass die direkte Interaktion von translatorischen GTPasen (trGTPasen) mit dem Sarcin-Ricin Loop (SRL) der rRNA die GTP-Hydrolyse katalysieren. Die unterschiedlichen postulierten Mechanismen blieben jedoch lückenhaft und wurden intensiv diskutiert. In den Kristallstrukturen zeigte sich, dass sich ein Phosphatsauerstoff des SRL-Nukleotids A2662 in unmittelbarer räumlicher Nähe zum potentiell katalytisch aktiven Histidin von EF-G (His87) befindet. Das primäre Ziel dieser Arbeit war es nun, diese Interaktion durch atomare Mutagenese auf ihre funktionelle Bedeutsamkeit hin zu evaluieren. Dies sollte in enger Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Norbert Polacek (Universität Bern) bewerkstelligt werden. Der Kern der ribosomalen, atomaren Mutagenese-Technik beruht auf der in vitro Rekonstruktion von funktionsfähigen ribosomalen 50S Partikeln aus einem zirkulär permutierten 23S rRNA Transkript, welches eine Lücke an der Stelle des SRLs aufweist. Diese Lücke wurde mit synthetisch hergestellten RNA Oligonukleotiden geschlossen, in denen einer der beiden nicht-verbrückenden Phosphatsauerstoffe des Restes A2662 durch eine Methylgruppe oder ein Schwefelatom ersetzt war. Dies wurde durch die Einführung eines Methylphosphonates (mP) oder eines Thiophosphates (PS) anstelle des natürlichen Phosphates erzielt (Abb. I). Über die Synthese von Methylphosphonat-modifizierter RNA war jedoch nur sehr begrenzt Information in der Literatur vorhanden. Aus diesem Grund wurde im Zuge dieser Dissertation der Ausarbeitung von geeigneten Synthese- und Entschützungsbedingungen von Methylphosphonat-modifizierter RNA ein hoher Stellenwert eingeräumt. Sowohl die Methylphosphonat- als auch die Thiophosphatmodifikation erzeugen Chiralität am Phosphoratom. Deshalb wurde ein kombinierter Ansatz aus chemischer Festphasensynthese, gefolgt von der Trennung der Diastereomere mittels Reversed-Phase HPLC, und Templat-unterstützter enzymatischer Ligation ausgearbeitet, der den individuellen Zugang zu den beiden möglichen diastereomeren RNAs (RP und SP) ermöglichte. Die korrekte stereochemische Zuordnung der beiden Diastereomere war eine entscheidende Voraussetzung für unsere Studie und wurden anhand von ROESY oder NOESY 1H,1H-NMR Spektroskopie bestimmt. Darüber hinaus gelang in Kooperation mit Eric Ennifar (CNRS Strasbourg) die Lösung der Kristallstruktur des RP-Diastereomeres einer A2662-Methylphosphonat-modifizierten SRL RNA mit einer Auflösung von 1.0 Å. Die hochauflösende Struktur zeigte, dass das Methylphosphonat eine nahezu identische Konformation einnimmt, wie sie für das entsprechende Phosphat in natürlicher RNA beobachtet wird. Mit all diesen Analysen konnte die strukturelle Integrität eindeutig belegt werden, was eine entscheidende Voraussetzung für die funktionellen Studien der GTP Hydrolyse war. Durch gemeinsame Arbeit mit Norbert Polacek erhielten wir A2662 Methylphosphonat-modifizierte, rekonstituierte Ribosomen, die zur Durchführung von ungekoppelten GTPase Hydrolyseexperimenten verwendet wurden. Unsere wichtigste Erkenntnis war, dass nur eines der beiden resultierenden Diastereomere, nämlich das SP Methylphosphonat, mit der effizienten GTPase-Aktivierung von EF-G kompatibel war. Zusätzlich konnten wir zeigen, dass die negative Ladung an der Phosphatgruppe des Restes A2662 für die Aktivität bei der GTP Hydrolyse erhalten bleiben muss. Zusammengefasst belegen die Ergebnisse, dass der nicht-verbrückende proSP Phosphatsauerstoff des Nukleosids A2662 im SRL maßgeblich an der Aktivierung der GTP Hydrolyse beteiligt ist. Die Positionierung des katalytisch aktiven, protonierten His87 durch Wasserstoffbrückenbindungen und elektrostatische Wechselwirkungen mit dieser Phosphatgruppe ist ein essentieller Bestandteil für den funktionellen Mechanismus der Aktivierung der trGTPasen durch das Ribosome (Abb. II). Der zweite Teil dieser Dissertation zielte auf die Erforschung des Ligand-induzierten Faltungsprozesses des kürzlich entdeckten Fluor-sensitiven Riboschalters ab. Die dreidimensionale Struktur der Aptamerdomäne des T. petrophila Fluorriboschalters wurde von Dinshaw J. Patel (MSKCC, NYC) und seiner Gruppe gelöst. Über den Faltungsprozesses dieses Riboschalters in Lösung existierte jedoch bis jetzt nur ein unzureichendes Bild. Um die lokalen strukturellen Änderungen beobachten zu können, führte ich deshalb das nicht-invasive, fluoreszierende Basenanalogon 2 Aminopurin (2AP) in den B. cereus crcB Riboschalter ein (Abb. III). Über die Fluoreszenzänderung von 2AP-modifizierten Sequenzen, welche durch Ligandenbindung ausgelöst wird, konnten sowohl thermodynamische als auch kinetische Daten ermittelt werden. Die Geschwindigkeitskonstante kon für die Ausbildung eines Basenpaares im Pseudoknoten, betrug 450 M-1 s-1. Dieser Wert steht für einen durchaus sehr langsamen Prozess angesichts der Tatsache, dass kon Werte für die Mehrheit der Riboschalter in der Größenordnung von 104 bis 105 M-1 s-1 liegen. Des Weiteren machen meine Ergebnisse deutlich, dass die Stämme P1 und P2 ein hohes Maß an Preorganisation aufweisen, Stamm P3 hingegen wird erst durch die Bindung von Fluorid stabilisiert. Im dritten Teil dieser Dissertation wird die chemische Syntheseroute für einen 2'-O-(3''-Aminopropyl)uridin-Phosphoramiditbaustein beschrieben (Abb. IV). Derartige Bausteine sind für die Derivatisierung von RNA mit fluoreszierenden Farbstoffen sehr wertvoll. Die jeweiligen Farbstoffe können nach erfolgtem Einbau in die RNA via NHS (N-Hydroxysuccinimid)-Chemie post-synthetisch an die primäre Aminofunktion geknüpft werden. Dies ist für moderne spektroskopische Methoden wie z.B. Einzelmolekül-Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (smFRET) Spektroskopie hoch relevant. Für die Farbstoffderivatisierung kommen verschiedene Positionen innerhalb der RNA in Frage, eine davon ist die Ribose 2'-Position. Das hier dargestellte 2' O-Aminopropyl-funktionalisierte Uridinphosphoramidit wird für eine zukünftige vergleichende Studie benötigt, bei der der Einfluss unterschiedlicher Verknüpfungslängen zwischen RNA und Fluoreszenzfarbstoff auf die spektroskopischen Eigenschaften untersucht werden soll.major goal of this thesis was to elucidate the role of the phosphate oxygen of A2662 of the ribosomal RNA (rRNA) in the chemical mechanism of elongation factor G (EF-G) mediated ribosomal translocation. EF-G-catalysed guanosine triphosphate (GTP) hydrolysis is a key reaction during the ribosomal elongation cycle. Recent crystal structures of G proteins, such as EF-G or elongation factor Tu (EF Tu) bound to the ribosome, as well as many biochemical studies, provide evidence that the direct interaction of translational GTPases (trGTPases) with the sarcin-ricin loop (SRL) of rRNA is pivotal for hydrolysis. However, the precise mechanism remained elusive and was intensively debated. Based on the structural observation of very close proximity between the phosphate oxygen of SRL residue A2662 and the supposedly catalytic histidine of EF-G (His87), the primary aim of this thesis was to probe this interaction by an atomic mutagenesis approach in a collaborative effort together with the Polacek group (University of Bern). The core of this technique is based on the in vitro reconstitution of functional 50S ribosomal particles from a circularly permuted 23S rRNA transcript that leaves a sequence gap lacking the SRL segment. This gap was filled with a synthetic RNA oligonucleotide in which either of the two nonbridging phosphate oxygens at A2662 was replaced with a methyl group or a sulphur atom by the introduction of a methylphosphonate (mP) or thiophosphate (PS) instead of the natural phosphate (Figure I). However, information on the synthesis of methylphosphonate modified RNA was limited in literature. Thus, a comprehensive study was performed within this thesis to establish conditions to synthesise and deprotect methylphosphonate containing RNA. Both the methylphosphonate and thiophosphate modifications generate chirality at the phosphor atom. Therefore, a combined approach of chemical solid-phase synthesis followed by separation of the diastereomers with optimised reversed-phase HPLC and template-assisted enzymatic ligation techniques was elaborated that allowed individual access to the two possible diastereomeric RNAs (RP and SP). Correct stereochemical assignment of the two diastereomers was a crucial prerequisite for our study and was performed on the basis of nuclear Overhauser enhancement (NOE) patterns observed in either ROESY or NOESY 1H,1H NMR spectra. Furthermore, in collaboration with Eric Ennifar (CNRS Strasbourg), we succeeded in solving the crystal structure of the RP diastereomer of a methylphosphonate modified SRL variant at a 1.0 Å resolution. This high-resolution structure revealed that the methylphosphonate adopts a similar conformation as observed for the specific phosphate in the natural RNA. Additionally, since the structural integrity of the methylphosphonate modification was a crucial prerequisite for the functional studies on GTP hydrolysis, we could verify this by thorough NMR and crystallographic analyses as well as thermodynamic studies. In a collaborative effort with Norbert Polacek, A2662 methylphosphonate-modified, reconstituted ribosomes were obtained in order to perform uncoupled GTPase assays. Our major finding was that only one of the two resulting diastereomers, the SP methylphosphonate, was compatible with efficient GTPase activation on EF-G. In addition, we provide evidence that the negative charge of the A2662 phosphate group must be retained for uncompromised activity in GTP hydrolysis. In summary, the data strongly corroborate that the nonbridging proSP phosphate oxygen at the A2662 of the SRL is critically involved in the activation of GTP hydrolysis. A mechanistic scenario is supported in which positioning of the catalytically active, protonated His87 through electrostatic interactions with the A2662 phosphate group and H-bond networks are key features of ribosome-triggered activation of trGTPases (Figure II). The second part of this thesis aimed a better understanding of the ligand-induced folding process of the recently discovered fluoride riboswitch. Efforts by others succeeded in solving the crystal structure of the aptamer domain of T. petrophila fluoride riboswitch, but a complete picture regarding the folding pathway of this riboswitch in solution is yet not fully drawn. Therefore, we used the 2-aminopurine approach that is based on the incorporation of the minimal-invasive, fluorescent base analog 2-aminopurine (2AP) into the riboswitch to follow local structural rearrangements. Monitoring of fluorescence changes of 2AP variants of the aptamer of the B. cereus crcB fluoride riboswitch enabled us to determine both thermodynamic and kinetic data (Figure III). The association constant kon found for a single nucleotide involved in pseudoknot formation was 450 M-1 s-1, which is remarkable given that kon values for the majority of riboswitch classes are in the range of 104 to 105 M-1 s-1. Furthermore, my investigations revealed that stem P1 and stem P2 display a high degree of structural pre-organisation, however, stem P3 becomes stabilised only upon fluoride binding. In the third part of this thesis, a straightforward synthetic route for a 2'-O-(3''-aminopropyl) uridine phosphoramidite building block (Figure IV) is described, following the lines of previously reported procedures. Derivatisation of RNA with fluorescent dyes is a prerequisite for their use in single molecule FRET experiments. Dyes can be post-synthetically attached to a primary amine via NHS (N-hydroxysuccinimide) chemistry at different positions within the RNA, one being the 2'-position. Thus, I focused on the synthesis of a 2'-aminopropoxy functionalised uridine phosphoramidite. This building block will be required for a comparative study to investigate the influence on spectroscopic properties that may arise from different linker lengths of fluorescent dyes attached to specific nucleoside 2'-positions within large RNAs.Sara FlürEnth. u.a. 1 Veröff. d. Verf. aus den Jahren 2015 . - Zsfassung in dt. SpracheInnsbruck, Univ., Diss., 2015OeBB(VLID)81342