Abiotic and biotic factors affecting methanogenesis of organic matter

anaerobe Vergärung von organischem Material wurde in den letzten Jahrzehnten intensiv untersucht. Bis dato wird sie jedoch zum Teil immer noch als eine Art „Black Box“ bezeichnet, bei der einige essentielle Informationen über die involvierten Mikroorganismen und Prozesse fehlen. Aus diesem Grund ist es nötig, den Stand des Wissens auf diesem Gebiet der erneuerbaren Energien zu erweitern. Der Grundstein für die vorliegende Doktorarbeit wurde durch ein Projekt (geleitet von Prof. Paul Illmer) gelegt, welches sich mit der Evaluierung von Steuerungsparametern der Biogasanlage Roppen (Österreich) beschäftigte. In dem thermophilen Propfenstromreaktor mit einem Gesamtvolumen von 900 m3 wird Methan produziert, welches schlussendlich in das Gasnetz eingespeist wird. Das Ziel der Doktorarbeit war es, das Verständnis von potentiellen Effekten einiger abiotischer und biotischer Faktoren auf die Gesamtperformance des anaeroben Vergärungsprozesses zu vertiefen. Die Untersuchungen wurden überwiegend mittels Batch-Kultivierung in Serumflaschen geführt, und verdünnter Fermenterschlamm der zuvor erwähnten Biogasanlage wurde als Inokulum verwendet. Die wichtigsten Methoden ermöglichten die qualitative und quantitative Charakterisierung des produzierten Biogases (GC, Druckmessung und Gaszähler), die Bestimmung der Konzentration von gelösten Zwischenprodukten (HPLC), wie auch die Charakterisierung der mikrobiellen Gemeinschaften (Denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese, quantitative PCR und verschiedene Arten der Mikroskopie). Im ersten Teil der Arbeit wurde der Fokus auf abiotische Faktoren gelegt. Die hemmenden wie auch förderlichen Effekte von verschiedenen Konzentrationen von volatile Fettsäuren (VFAs) und Ammonium wurden bestimmt, und es zeigte sich, dass nur Formiat zu einer starken Methanproduktion innerhalb weniger Tage ohne nennenswerter lag-Phase führte. Weiters konnte eine Toleranz gegenüber hohen Formiat-Konzentrationen (bis zu etwa 100 mM) festgestellt werden. Auch bei Ammonium konnte eine hohe Toleranz ermittelt werden, höchstwahrscheinlich auf Grund hoher Konzentrationen im Fermenterschlamm. Darüber hinaus konnte belegt werden, dass die Schüttelgeschwindigkeit relevant für die Methanproduktion war, und zwar führte moderates Schütteln zur höchsten Methanproduktion. Während weiteren Experimenten wurde mittels analytischen und molekularbiologischen Methoden sowie thermodynamischen Berechnungen der Abbau von Formiat in einem Intervall von 12 h über 7 d verfolgt. Außerdem wurden die Effekte von elf Antibiotika und dem Methanogenen-Inhibitor 2-Bromethansulfonat (BES) auf den VFA-Abbau, die Methanproduktion, und die Veränderung der Populationsstruktur von Archaea und Bacteria untersucht. Interessanterweise zeigten nur BES und die Antibiotika Neomycin, Gentamicin und Rifampicin, welche in die Proteinsynthese eingreifen, signifikante Effekte. Neomycin und BES inhibierten den Acetat-Abbau komplett und in einem gewissen Ausmaß auch den von Propionat und Butyrat. Gentamicin und Rifampicin führten zu einer kompletten Hemmung des Propionat- und Butyratabbaus, während die Methanogenese aus Acetat nicht beeinflusst wurde. Während eines weiteren Teils der vorliegenden Arbeit konzentrierten wir uns auf den biotischen Hintergrund der anaeroben Vergärung, und hier wiederum auf potentielle „Schlüssel-Organismen“, die essentiell für die Prozesse sind. In einem ersten Schritt wurden mikrobielle Konsortien etabliert und in Bezug auf ihre Kapazität, den anaeroben Vergärungsprozess während verschiedenen Phasen zu verbessern, evaluiert. Im Zuge des ersten Experimentes wurde einem anaeroben Vergärungsprozess nach einer 30-tägigen Stagnationsphase eine Acetat-abbauenden Anreicherungskultur zugegeben, die laut molekularbiologischen Untersuchungen vor allem aus Vertretern der acetoclastischen, methanogenen Gattung Methanosarcina bestand. Diese Bioaugmentation führte zu einer drastischen Reduktion der akkumulierten VFAs und zu einer Wiederaufnahme der Methanogenese. In einem weiteren Experiment wurden mikrobielle Konsortien aus dem Fermenterschlamm isoliert, mittels verschiedenen Strategien an erhöhte Acetatkonzentrationen adaptiert und anschließend hinsichtlich ihrer Toleranz gegenüber Acetat evaluiert. Obwohl eine hohe Abundanz der Vertreter der hydrogenotrophen Gattung Methanoculleus festgestellt werden konnte, was auf eine potentielle syntrophe Acetat-Oxidation hindeutete, wurden diese Organismen durch die verschiedenen Anreicherungsstrategien offensichtlich kaum beeinflusst. Jedoch bewirkten die Anreicherungen signifikant unterschiedliche Acetatabbau- und Methanogeneseraten. Somit konnte der beschleunigte Start-up unter hohen Acetatkonzentrationen dem bemerkenswerten Anstieg der Vertreter von Methanosarcina spp. zugeschrieben werden. Die vorliegenden Resultate betonen das große Potential der acetoclastischen Methanosarcina spp. zur Methanogenese aber auch die Robustheit von Vertretern der hydrogentrophen Gattung Methanoculleus. Obwohl die präsentierten Bioaugmentationen sehr erfolgsversprechend scheinen, um Prozesse zu verbessern und um verschlechterten Bedingungen entgegenzuwirken, sind noch weitere Untersuchungen nötig, ehe man ein „Upscaling“ hin zu Biogasanlagen beginnt.anaerobic digestion of organic matter was intensely investigated during the last decades. However, it is often called a ‘black box where some essential information about the involved microorganisms and processes is missing. Therefore, it is required to increase the state-of-the-art knowledge in this field of renewable energies. The foundation for the present Doctoral Thesis was laid by a project (headed by Prof. Paul Illmer), which dealt with the evaluation of the process parameters of a biogas plant located in Roppen (Austria). In the thermophilic plug-flow reactor with a total volume of 900 m3, methane is produced, which finally gets injected into the gas grid. The aim of the Doctoral Thesis was to gain a better understanding of the potential effects of several abiotic and biotic factors on the overall performance of the anaerobic digestion process. The investigations were predominantly performed as batch cultivations in serum bottles, and diluted fermenter sludge of the above mentioned biogas plant was used as inoculum. The most relevant methods enabled the determination of the quality and quantity of the evolved biogas (GC, pressure detection, and gas counter), the concentration of the dissolved intermediates (HPLC), as well as the characterization of the microbial consortia (denaturing gradient gel electrophoresis, quantitative PCR, and different types of microscopic observations). At the first part of the work the focus was put on abiotic factors. The inhibiting but also beneficial effects of different concentrations of volatile fatty acids (VFAs) and ammonium were determined. Only formate led to a distinct methane production within a few days without a relevant lag-phase. Furthermore, a tolerance to high formate concentrations (up to about 100 mM) was determined. Also towards ammonium a high tolerance was observed, most probably due to high concentrations already present in the fermenter sludge. Additionally, it was also able to prove that the agitation speed was relevant for the production of methane with a moderate agitation leading to the highest methane production. During another set of experiments the formate degradation was monitored with an interval of 12 h for 7 d with analytical and molecular biological methods as well as thermodynamic calculations. Last but not least, eleven antibiotics and the methanogen-inhibitor 2-bromoethanesulfonate (BES) were investigated for their effects on VFA degradation, methane production, and alteration of the population structure of archaea and bacteria. Interestingly, only the protein synthesis interfering antibiotics neomycin, gentamicin and rifampicin, and BES showed significant effects. Neomycin as well as BES completely inhibited the degradation of acetate, and to some extent of propionate and butyrate. Gentamicin and rifampicin led to a complete inhibition of the propionate and butyrate degradation, while methanogenesis from acetate was not affected. During a further section of the present work the focus was laid on the biotic background of the anaerobic digestion, and especially so called ‘key organisms, which are capable to carry a large part of the whole process, were investigated. Microbial consortia were developed and evaluated for their capacity to improve the anaerobic digestion process during different stages. Within the first experiment, an acetate-degrading enrichment culture was applied to an anaerobic digestion process after a 30-day stagnation phase. According to molecular biological investigations representatives of the acetoclastic methanogenic genus Methanosarcina were the key organisms within this enrichment culture. ^This bioaugmentation led to a decrease of the accumulated VFAs, and thus to a restart of methanogenesis. In a second experiment, microbial consortia were isolated from the fermenter sludge, with different strategies adapted to increased acetate concentrations, and subsequently evaluated regarding their sensitivity towards high acetate loads. Although high numbers of the hydrogenotrophic methanogens Methanoculleus spp. were detectable, which pointed to a potential syntrophic acetate oxidation, they were hardly affected by the different enrichment procedures. However, the enrichments showed significant different acetate degradation and methanogenesis rates. Thus, the considerable increase of representatives of Methanosarcina spp. should have been responsible for the improved start-up under high acetate loads. The presented results emphasize the potential of the acetoclastic Methanosarcina spp. for high-rate methanogenesis, as well as the robustness of the members of the hydrogentrophic genus Methanoculleus. Although the presented bioaugmentations seem to be promising to improve processes and to counteract deteriorated conditions, further investigations might be required before an upscaling towards biogas plants is planned.Philipp LinsEnth. u.a. 7 Veröff. d. Verf. aus den Jahren 2009 - 2015 . - Zsfassung in dt. SpracheInnsbruck, Univ., Diss., 2015OeBB(VLID)77978