Consequences of spontaneous mouse melanoma development on the immunological landscape

Experimentelle Mausmodelle welche auf einer bekannten genetischen Mutation beruhen, sind wertvolle Instrumente um Ursachen und Entstehung einer ihr zu Grunde liegenden Krankheit besser zu verstehen. Überexpression des metabotroben Glutamat Rezeptors 1 (Grm1) in Melanozyten kann in ungefähr 60% aller Patienten mit malignen Melanom beobachtet werden. Das transgene Mausmodell (Grm1)EPv basiert auf der Überexpression dieses Rezeptors in Melanozyten, welches ähnlich wie beim Menschen, zur Entstehung eines malignen Melanoms führt. Da in diesem Mausmodell noch nichts über den Einfluss der Entstehung eines malignen Melanoms auf das Immunsystem bekannt war, war es Ziel dieser Doktorarbeit dies genauer zu untersuchen. In diesem Mausmodell beobachteten wir bei Tumorwachstum eine Reduktion der CD4+ sowie regulatorischen T-Zellen in Bezug auf alle CD45+ Leukozyten in der Haut und den dränierenden Lymphknoten. Im Gegensatz dazu blieben die CD8+ T-Zellen prozentuell unverändert, wobei diese eine verstärkte Aktivierung in der Gegenwart des Tumors aufwiesen. Auch die Anzahl CD8+ T-Zellen spezifisch für das Glykoprotein (gp) 100, ein Antigen das bei der Entstehung eines malignen Melanoms überexprimiert wird, blieb im Tumor konstant. Bemerkenswerter Weise war es nicht möglich, diese Zellen mit gp100 Peptid zu stimulieren. Des Weiteren führte das Voranschreiten des Tumors zu einer Infiltration myeloider Suppressorzellen. Ähnlich wie beim Menschen, konnte eine vermehrte Anhäufung granulärer myeloider Suppressorzellen gegenüber monocytärer myeloider Suppressorzellen im Tumorgewebe festgestellt werden. Weiterführende Experimente zur Überprüfung der supprimierenden Funktion der myeloiden Suppressorzellen konnten bestätigen, dass beide Zelltypen in der Lage waren, gp100-spezifische T-Zell Antworten zu unterdrücken. Die Entstehung des malignen Melanoms führte auch zu einer Veränderung des Phänotyps dendritischer Zellen sowie des dendritischen Zell-Netzwerkes in der Haut. Es konnte eine signifikante Reduktion Langerin+ dermaler dendritischer Zellen festgestellt werden, welche sich durch eine verringerte Expression der kostimulatorsichen Oberflächenmoleküle CD40 und IL-15R auszeichneten. Darüber hinaus war die Anzahl aller Haut migrierender dendritischen Zellen in dränierenden Lymphknoten fortgeschrittener Tumore reduziert. Um die Fähigkeit der Kreuzpräsentation und Initiierung von Antigen-spezifischen CD8+ T Zell Antworten der dendritischen Zellen der Haut zu untersuchen, wurden gp100-spezifische CD8+ T-Zellen in tumorfreie und tumortragende Mäuse injiziert. Der Zelltransfer war aufgrund der geringen Anzahl endogener gp100-spezifischer CD8+ T-Zellen notwendig und führte bei den injizierten Zellen zu einer vermehrten Zellteilung und Differenzierung in Effektor-Gedächtnis Zellen. Diese beobachteten Effekte wurden in der Gegenwart eines malignen Melanoms noch weiter verstärkt. Interessanterweise führte die Depletion Langerin+ dendritischer Zellen in tumorfreien Mäusen zu einer signifikanten Reduktion der T-Zell Aktivierung. Dieser Effekt konnte jedoch durch die Rückkehr Langerin+ dermaler dendritischer Zellen in die Haut aufgehoben werden. Ähnliches konnte auch in tumortragenden Mäusen beobachtet werden, doch waren die Reaktionen im Vergleich dazu weitaus schwächer, da die Repopulation Langerin+ dendritischer Zellen gestört war. Dies führte dazu, dass Langerin+ dermale dendritische Zellen als auch Langerhans Zellen bereits nach zwei Wochen wieder zurück waren. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich Tumore des transgenen (Grm1)EPv Mausmodells durch ein immunsuppressives Milieu auszeichnen, welches antigen-spezifische CD8+ T-Zellen unempfindlich gegenüber Tumorantigen macht. Dieser Effekt wurde bereits in Patienten mit malignen Melanom beobachtet. Darüber hinaus deuten unsere in vivo Daten drauf hin, dass Langerin+ dendritische Zellen bei der Initiierung antigen-spezifischer CD8+ T Zell Antworten involviert sind. Die Ergebnisse dieser Doktorarbeit können für die Verbesserung bereits bestehender auf dendritischen Zellen-basierenden Immuntherapien genutzt werden.Murine mouse models mimicking the human disease are valuable tools to gain insights into tumor etiology and tumor immunology. The transgenic (tg) mouse model tg(Grm1)EPv is based on the over-expression of the metabotropic glutamate receptor 1 (Grm1), causing spontaneous melanoma development with 100% penetrance. Relevance of this model is given by the fact that up to 60% of human melanoma samples are characterized by the same ectopic expression of Grm1. Although the tg(Grm1)EPv mouse was used in several studies, nothing was known how melanoma development would affect the immune system in tumor-bearing mice. Melanoma development was accompanied by a reduction of CD4+ T cells including regulatory T cells (Tregs) in the CD45+ leukocyte pool present in tumor tissue and skin-draining lymph nodes (LN). In contrast, percentages of CD8+ T cells were unchanged and these cells showed an activated phenotype in tumor-bearing mice. Endogenous CD8+ T cells specific for the melanoma-associated antigen glycoprotein (gp) 100 were not deleted during tumor development, as revealed by pentamer staining in skin and draining LN. However, CD8+ T cells were unresponsive to ex vivo restimulation with gp100. Interestingly, immunosuppressive myeloid-derived suppressor cells (MDSC) were recruited to tumor tissue with a preferential accumulation of granulocytic MDSC (grMDSC) over monocytic MDSC (moMDSC). Both subsets suppressed gp100-specific transgenic CD8+ T cell responses in vitro. Tumor development also altered the network and phenotype of skin dendritic cells (DC). Langerin+ dermal DC were reduced in their numbers and characterized by abrogated CD40 and IL-15R expression in late-stage tumors. In addition, we observed a decrease in numbers for all migratory DC subsets in LN draining late-stage tumors. Because it is still not clear which DC subset is responsible for cross-presentation to initiate tumor-specific CD8+ T cell responses, we used the tg(Grm1)EPv mouse model to further elucidate this question. Due to the low number of endogenous gp100-specific CD8+ T cells, we adoptively transferred gp100-specific CD8+ T cells from T cell receptor transgenic mice. Proliferation of these cells was increased in the tumor situation as compared to tumor-free mice. In addition, these cells also acquired an effector memory phenotype (TEM). In tumor free mice depletion of Langerin+ DC impaired the activation of adoptively transferred CD8+ T cells. We found less proliferation and fewer TEM cells and this effect could only be restored when Langerin+ dermal DC, but not Langerhans cells (LC) repopulated the skin and draining LN. In mice bearing late-stage tumors, repopulation of Langerin+ DC was deregulated and both subsets, namely Langerin+ dermal DC and LC were back in the skin 2 weeks after depletion. We still observed decrease in T cell proliferation and function shortly after depletion, which was abolished by repopulation of Langerin+ dermal DC and LC. All in all the differences were less pronounced as compared to tumor-free mice. In summary, we could show that tumors in this spontaneous mouse melanoma model are characterized by an immunosuppressive microenvironment that renders endogenous CD8+ T cells unresponsive to tumor antigen, resembling the situation observed in human melanoma patients. Furthermore, in vivo experiments suggested that Langerin+ DC seem to be involved in initiating antigen-specific CD8+ T cell responses against melanoma. This knowledge could be used to improve the efficacy of existing DC-based immunotherapies.by David MairhoferEnth. u.a. 4 Veröff. d. Verf. aus den Jahren 2014 - 2015 . - Zsfassung in dt. SpracheInnsbruck, Med. Univ., Diss., 2015OeB