Identification of differentially expressed small non-coding RNAs as diagnostic markers in central nervous system disorders

Das Zentrale Nervensytem (ZNS) ist das komplexeste Organ im menschlichen Körper und exprimiert ungefähr 80% aller protein-kodierenden Gene. Die Regulation dieser Gene wird wiederum von einem weitaus komplexeren System an nicht protein-kodierenden RNAs (ncRNAs) übernommen. Die zumeist kurzen regulatorischen ncRNAs wurden mit verschiedenen Prozessen des ZNS in Verbindung gebracht und sind beispielsweise in der Regulation von Genexpression, epigenetischen Zustand, neuronaler Plastizität sowie in Alterungsprozessen im Gehirn involviert. Die meisten Studien haben sich im letzten Jahrzehnt auf eine mittlerweile sehr gut beschrieben Klasse von ncRNAs, den microRNAs (miRNAs) beschränkt. Hierzu gibt es mittlerweile zahlreiche etablierte bioinformatische und experimentelle Methoden. Andererseits gibt es kaum standardisierte Methoden zur Untersuchung weniger gut beschriebener bzw. gänzlich unbekannter ncRNAs, obwohl diese den Großteil der vorhandenen ncRNAs ausmachen. In dieser Dissertation wurden kurze regulatorische ncRNAs mit bioinformatischen Methoden identifiziert, welche im zentralen Nervensystem und des weiteren in neurodegenerativen Erkrankungen eine funktionelle Rolle einnehmen. Mittels differenzieller Expressionsanalyse wurden RNA-Seq Daten von embryonalen Stammzellen der Maus, neuronalen Vorläuferzellen und ausdifferenzierten neuronalen Zellen untersucht. Um möglichst alle ncRNAs zu identifizieren, welche in der neuronalen Entwicklung von Bedeutung sind wurden in weiterer Folge murine Hirn und Spinalganglien sequenziert und bioinformatisch selektiert. Basierend auf diesen Daten wurde ein neuro-spezifischer Microchip entwickelt, der zum Screening unterschiedlicher Expressionsmuster von ncRNAs in neurodegenerativen Erkrankungen verwendet werden kann. Der Vorteil gegenüber anderen Technologien ist dabei, dass kurze aber auch längere strukturierte ncRNAs auf ein und demselben Microchip untersucht werden können. Für die Generierung des Microchips wurde ein eigens dafür entwickeltes computer-unterstütztes Selektionsverfahren verwendet, welches Oligonukleotide anhand von Expressionsprofilen in den Sequenzierdaten auswählt. Zusätzlich wurden bioinformatisch vorhergesagte ncRNAs bei der Mikrochip Erstellung inkludiert, welche sich im Intron, in antisense Richtung zum Exon, oder in der Nähe von krankheitsassozierten protein-kodierenden Genen befinden. In einer während dieser Dissertation durchgeführten Studie wurden Expressionsprofile von drei neurodegenerativen murinen Modellen mittels Mikrochips untersucht. Die ersten zwei Modelle sind mit der Parkinson-Krankheit und Epilepsie assoziiert, dagegen weist das dritte Model patho-physiologische Merkmale der Alzheimer-Krankheit auf. Nach Auswertung der Ergebnisse konnten 119 unterschiedlich exprimierte ncRNAs identifiziert werden. Da zwei ncRNAs, welche im frühen Stadium der Alzheimer Krankheit unterschiedliche Expressionsmuster zeigten, im Liquor cerebrospinalis von Patienten detektiert werden konnten, ist deren Verwendung als Biomarker denkbar.The central nervous system (CNS) represents the most complex biological system in the human body, expressing about 80% of all protein-coding genes which are tightly regulated. Numerous reports have uncovered hidden layers of complexity by showing that non-protein-coding RNAs (ncRNAs) play keyroles in neural development, neural differentiation, neural plasticity and brain aging by regulating gene expression and epigenetic status. The majority of studies focused on microRNAs (miRNAs), for which several experimental, as well as computational analysis methods have been developed. However, much less attention has been paid to all other classes of small ncRNAs; from these, about 450,000 ncRNA transcripts have been predicted to be transcriped from the human genome which do not code for proteins, but may exert regulatory roles in gene expression. This work focused on the identification of small regulatory ncRNAs, involved in neuro-developmental disorders of the CNS. Therefore, novel ncRNAs were identified and preselected by differential expression analysis of RNA-Seq data from embryonic stem cells (ES cells) differentiated into neural cells. Following this study, RNA-Seq data from total mouse brain and murine dorsal root ganglia were bioinformatically analyzed, by employing a previously in-house developed computational pipeline, designated as APART and novel ncRNA candidates were predicted. Based on these data, a custom neuro-ncRNA microarray expression profiling platform was developed. For the design of the microarray, a computational pipeline was developed which selected oligonucleotides based on expression profiles in RNA-Seq data. In addition to the experimentally obtained data, computational ncRNA predictions were performed and added to the microarray which were located in introns, antisense to exons, or close to protein-coding genes associated with common CNS disorders. Expression profiling of two mouse models implicated in Epilepsy or Parkinsons disease, respectively, as well as in a mouse model mimicking patho-physiological aspects of Alzheimers disease, revealed 119 differentially expressed ncRNAs. Two of these could be detected experimentally in cerebral spine fluid (CSF) of human patients. Thereby, both ncRNAs showed differential expression in early stages of Alzheimers disease and thus might have the potential to serve as early diagnostic markers.Simon SchaffererAbweichender Titel laut Übersetzung der Verfasserin/des VerfassersEnth. u.a. 1 Veröff. d. Verf. aus den Jahren 2012 . - Zsfassung in dt. SpracheInnsbruck, Med. Univ., Diss., 2014OeBB(VLID)21644