Diversidad de las comunidades microbianas adherentes en biopsias de mucosa colónica de pacientes chilenos y españoles con enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa

Tesis entregada a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al grado de Doctor en Ciencias con mención en MicrobiologíaLa mayor concentración y diversidad de microorganismos asociados a la microbiota humana reside en el intestino, estableciendo una relación comensal o mutualista con el hospedero, la cual puede verse interrumpida cuando la estructura y composición microbiana es alterada (disbiosis). La disbiosis puede estar asociada a cambios en la dieta, el uso de antibióticos y en una serie de enfermedades, entre ellas las enfermedades inflamatorias intestinales (EII) como Colitis Ulcerosa (CU) y Enfermedad de Crohn (EC). Si bien la mayor parte de los estudios sobre microbiota intestinal se han realizado a partir muestras de heces debido a su fácil obtención, la microbiota adherente del colon es la más representativa de la comunidad microbiológica que co-evoluciona con el hospedero en el transcurso de la enfermedad, pues ésta puede interactuar de forma más directa con el sistema inmunitario. Considerando los antecedentes expuestos el objetivo de esta tesis es la caracterización de la microbiota adherente de individuos con EII mediante análisis de secuenciación masiva y generación de librerías de rDNA16S, a partir de muestras de biopsias de individuos chilenos y españoles (n=66) diagnosticados con EC, CU y controles (CTL). Nuestros resultados mostraron diferencias significativas entre la abundancia relativa de las phyla Proteobactería y Firmicutes entre individuos con EII y CTL, sin embargo no observamos diferencias significativas entre la microbiota de individuos con CU y EC. Por otro lado, a diferencia de los estudios realizados con muestras de heces, donde los individuos con EII fueron clasificados en grupos únicos y definidos (EC, CU o CTL), en nuestro estudio los individuos con EII se clasificaron en 5 grupos distintos según su composición microbiana. Los grupo denominados EII-1, EII-3, EII-2 y EII-5 albergaron únicamente individuos con EC y CU, presentando un enriquecimiento de las phyla Bacteroidetes (34.5%), Proteobacteria (75.4%), y de las Unidades Filogenéticas Operacionales (OPUs) afiliadas a las bacterias Ruminococcus gnavus (9.75%); Cupriavidus necator/Ralstonia pickettii (6.60%); Brevundimonas diminuta/Brevundimonas vancanneytii (5.87%) y Klebsiella oxytoca (32.16%). El grupo EII-4 contuvo individuos con EII y CTL mostrando un enriquecimiento del phylum Firmicutes (59.85%) y OPUs afiliados a Faecalibacterium prausnitzii (14.67%), (bacteria características de individuos sanos). Sumado a los anterior aquellos individuos pertenecientes a los grupos EII-3, EII-2 y EII-5 presentaron abundancias que abarcaron entre el 12.74 al 55.60% en OPUs afiliados a bacterias anaeróbicas facultativas y abundancias del 4.25% al 9.68% en OPUs afiliados a bacterias aeróbias estrictas. Por el contrario, los grupos EII-4 y EII-1 abarcaron abundancias del 41.21% al 45.3% en OPUs afiliados a bacterias anaerobias obligadas y abundancias cercanas al 1.5% en OPUs afiliados a bacterias aerobias estrictas. Además, los análisis de correlación mostraron asociaciones negativas entre los OPUs anaerobios facultativos o aerobios, (indicadores de individuos con EII pertenecientes a los grupos EII-1, EII-2, EII-3, EII-5) con aquellos OPUs anaerobios (indicadoras de EII-4). Este tipo de correlación da cuenta de relaciones de competencia (exclusión) entre estas bacterias, dadas posiblemente por las condiciones ambientales del intestino, es decir un incremento en los niveles de oxígeno durante el proceso de inflamación. Estos resultados concuerdan con lo sugerido en la “hipótesis del oxígeno”, donde se plantea que en condiciones de inflamación crónica las paredes intestinales de individuos con EII conducen a una mayor liberación de hemoglobina (que lleva oxígeno), y especies reactivas de oxígeno a la luz del intestinal. Sumado a lo anterior, los colonocitos bajo señales pro-inflamatorias realizarían un cambio en su metabolismo hacia una glicólisis anaeróbica, la cual no consume oxígeno permitiendo que este difunda hacia el epitelio intestinal conduciendo así un ambiente favorable para bacterias anaerobias facultativas y aerobias. En este contexto, uno de los componentes de la respuesta inmune innata que parece controlar la población que conforma la microbiota intestinal son los péptidos antimicrobianos (PAMs). Entre los PAMs estudiados en el epitelio colónico se encuentran las Catelicidina (CAMP) y β-defensinas (hBD), los cuales poseen actividad antimicrobiana sobre grupos bacterianos específicos. Modelos murinos que sobreexpresan PAMs muestran una disbiosis con respecto a sus pares silvestres, dando cuenta de la importancia de los PAMs como reguladores de la composición microbiana intestinal. Adicionalmente, investigaciones recientes han demostrado que pacientes con EII poseen una expresión alterada de PAMs con respecto a individuos CTL. En esta línea de pensamiento, esta tesis propuso como hipótesis “El aumento de la población de Proteobacteria observado en la mucosa intestinal en pacientes con EC con respecto a pacientes CU, se asocia con la disminución en la expresión de péptidos antimicrobianos CAMP y hBD 2-4”. Sin embargo, debido al bajo número de muestras que permitieran obtener un RNA íntegro y de calidad para analizar los niveles de expresión de los PAMs CAMP y hBD-2, no fue posible demostrar que nuestros resultados fueron significativos en la correlación con respecto a los phylum bacterianos. En esta condición esta hipótesis no puede ser aceptada ni rechazada.The highest concentration and diversity of microorganisms belonging to the human microbiota reside in the intestine, establishing a commensal or mutualistic relationship with the host. This relationship can be modified when the microbial structure and composition is altered (dysbiosis). Dysbiosis may be associated to changes in diet, use of antibiotics and to a number of diseases, including inflammatory bowel diseases (IBD) such as Ulcerative Colitis (UC) and Crohn's Disease (CD). Although, due to the easiness to collect them, most of the studies on intestinal microbiota are carried out analyzing stool samples, the adherent microbiota of the colon is representative of the microbial community which co-evolves with the host, interacting directly with the immune system, during the course of the disease. Considering the above, the aim of this thesis was to characterize the adherent microbiota of individuals suffering IBD by means of massive sequencing analysis. Samples (biopsies) were obtained from Chilean and Spanish individuals (n = 66) diagnosed with CD, UC, and control (CTL). Our results showed significant differences between the relative abundance of phyla Proteobacteria and Firmicutes among individuals with IBD and CTL but no differences were observed when comparing the microbiota of individuals with UC and CD. Unlike the studies based on stool samples, in which individuals with IBD are classified as unique and defined groups (CD, CU or CTL) in our study individuals with IBD were classified into five different groups according to their microbial composition. Groups IBD-1, IBD-3, IBD-2 and IBD-5 contained only individuals with CD and UC, presenting an enrichment of phyla Bacteroidetes (34.5%) and Proteobacteria (75.4%) and Operational Phylogenetic Units (OPUs) affiliated with bacteria Ruminococcus gnavus (9.75%) ;Cupriavidus necator / Ralstonia pickettii (6.60%); Brevundimonas diminuta / B revundimonas vancanneytii (5.87%) and Klebsiella oxytoca (32.16%). Group IBD-4 contained individuals with IBD and CTL showing an enrichment of phylum Firmicutes (59.85%) and OPUs affiliated with Faecalibacterium prausnitzii (14.67%), (bacterium characteristic of healthy individuals). In addition to the above, individuals belonging to groups IBD-3, IBD-2 and IBD-5 showed abundances between 12.74 to 55.60% of OPUs affiliated to anaerobic or facultative bacteria, and abundances of 4.25% to 9.68% of OPUs affiliated to obligate aerobes. On the contrary, groups IBD-4 and IBD-1 showed abundances of 41.21% to 45.3% of OPUs affiliated with obligated anaerobic bacteria and abundances close to 1.5% of OPUs affiliated to obligated aerobic bacteria. In addition, correlation analyzes showed negative associations between facultative anaerobic and aerobic OPUs (indicators of individuals with IBD belonging to groups IBD-1, IBD-2, IBD-3, IBD-5) with those obligated anaerobic OPUs (indicators of IBD-4). This kind of correlation exemplifies competition relationships (exclusion) between these bacteria, possibly due to the environmental conditions of the intestine, i.e. an increase in oxygen levels during the process of inflammation. These results are consistent with the "oxygen hypothesis" which proposes that in/under conditions of chronic inflammation, causing the release of oxygen carrying hemoglobin in the intestinal mucosa and reactive oxygen species in the intestinal lumen. In addition, colonocytes under pro-inflammatory signals shift their metabolism towards an oxygen consuming anaerobic glycolysis, increasing epithelial oxygenation which leads to a favorable environment for facultative and aerobic bacteria. One of the components of the innate immune response that seems to control the microbial population are the antimicrobial peptides (AMPs). Among the AMPs studied in the colonic epithelium, Cathelicidin (CAMP) and β-defensins (hBD), which have antimicrobial activity on specific bacterial groups, can be mentioned. Murine models overexpressing AMPs showed a dysbiosis when compared to their wild type mates, revealing the importance of AMPs as regulators of the intestinal microbial composition. Additionally, recent research showed that patients with IBD have an altered expression of AMPs when compared to CTL individuals. In this context, this thesis proposed the following hypothesis: "The increase in the population of Proteobacteria observed in the intestinal mucosa in patients with CD when compared to patients with UC is associated with the decrease in the expression of antimicrobial peptides CAMP and hBD 2-4". However, due to the low number of samples that allowed to obtain a high-quality RNA to analyze the levels of expression of the CAMP and hBD-2 MAPs, it was not possible to demonstrate that our results were significant in the correlation of MAPs with bacterial phyla. In this condition this hypothesis cannot be accepted or rejected.Fundación Maria Ghilardi, beca para estudios de postgrado durante el año 2013, Comisión Nacional de Ciencia y Tecnología (CONICYT-21140975), beca para estudios de Doctorado (años 2014-2017) y FONDECYT 1161161