The role of human antigen R (HuR) in myofibroblast differentiation: implications for pulmonary fibrosis

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is an under-diagnosed lung disease characterized by progressive lung scarring with median survival of 3-5 years from initial diagnosis. Although the etiology of IPF is unclear, excessive extracellular matrix (ECM) deposition is a key event in disease pathogenesis. ECM -particularly collagen and fibronectin- is excessively deposited due to increased differentiation of fibroblasts into the α-SMA-expressing myofibroblasts by transforming growth factor (TGF) β1. We predict that TGFβ1 promotes fibrosis via human antigen R (HuR), an RNA binding protein whose principle function is to promote protein translation. HuR is localized in the nucleus under normal conditions, but upon translocation from the nucleus to the cytoplasm, HuR may promote the translation of pro-fibrotic ECM mRNA (including TGFβ1) into protein. The role of HuR in the differentiation of fibroblasts to myofibroblasts in association with ECM deposition is completely unknown. Therefore, we hypothesize that HuR promotes fibrosis by inducing the differentiation of fibroblasts to myofibroblasts and increasing ECM deposition. The aims of this study are: (1) Determine whether HuR regulates the differentiation of fibroblasts into myofibroblasts; and (2) Evaluate potential HuR mRNA targets implicated in the fibrotic process. To first explore the role of HuR in fibroblast differentiation, human lung fibroblasts (HLFs), were treated with TGFβ1 (5 μg/ml) and the mRNA and protein expression of HuR as well as the fibrogenic (α-SMA(ACTA2), collagen (COL1A1 and COL3A1) and fibronectin (FN1)) markers were evaluated by qRT-PCR and western blot, respectively. Exposure of HLFs to TGFβ1 increased expression of α-SMA, collagen and fibronectin but there was no change in HuR levels. Next, cytoplasmic and nuclear protein fractions were obtained from TGFβ1-treated HFLs to assess HuR localization by western blot. In addition, immunofluorescence (IF) was also used to assess cellular localization of HuR in response to TGFβ1. There was a significant increase in translocation of HuR from the nucleus to the cytoplasm- a feature consistent with HuR activation. To now confirm whether HuR was necessary to promote fibroblast differentiation, HLFs were transfected with HuR siRNA (siHuR) or control (scramble) siRNA (siCtrl), treated with TGFβ1 and fibrotic markers assessed as above. These results showed that siHuR-transfected cells had a significant reduction in α-SMA (ACTA2) expression, but no change on collagen I (COL1A1), III (COL3A1) or fibronectin (FN1) mRNA. Next, Actinomycin D (ActD)-chase experiments were performed to examine if HuR affects the stability of these transcripts. HuR knock-down did not affect mRNA stability of ACTA2, COL1A1, COL3A1 or FN1. Finally, RNA-immunoprecipitation (RIP) was performed to assess binding of HuR to the mRNA of ACTA2, COL1A1, COL3A1 and FN1 mRNA. These results show that in response to TGFβ1, there is enrichment of HuR binding to ACTA2, COL1A1, COL3A1 but not FN1 mRNA. This study is the first to investigate the role of HuR in fibroblast differentiation to myofibroblasts and consequent production of ECM. Data provided herein sets the stage for further studies aimed at investigating the role of HuR in the pathogenesis of IPF. Research on HuR could assist in establishing the basis for the development of new target therapy for fibrotic diseases such as IPF.La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une lésion des poumons de cause inconnue. C'est une maladie très sous-diagnostiquée avec une survie médiane de 3 à 5 ans après le diagnostic. FPI est provoquée par une cicatrisation anormale dans les poumons causant un dépôt excessif de matrice extracellulaire (MCE) dans l'interstitium pulmonaire. Le dépôt excessif de collagène et fibronectine se produit grâce à la différenciation accrue des fibroblastes en myofibroblastes. Ces dernières expriment la protéine a-SMA (pour alpha smooth muscle actin) sous l'influence du facteur de croissance transformant beta 1 (TGFβ1). Nous suggérons que TGFβ1 favorise la fibrose pulmonaire via une protéine nommée HuR (pour human antigen R). HuR une protéine de liaison à l'ARN fonctionnellement impliquées dans le transport, stabilité et traduction des ARN messagers (ARNm). Dans les conditions normales HuR est localisé dans le noyau. Cependant, en présence d'un stimulus, HuR se transloque vers le cytoplasme pour favoriser la traduction des ARNm en protéines, y compris les ARNm pro-fibrotiques (e.g. TGFβ1). Le rôle de HuR dans la différenciation des fibroblastes en myofibroblastes et dans le dépôt de MCE est complètement inconnu. Les objectifs de cette étude sont: (1) Déterminer si HuR régule la différenciation des fibroblastes en myofibroblastes; et (2) Évaluer les cibles potentielles (ARNm) de HuR impliquées dans les processus fibrotiques.Pour répondre à la première question, des fibroblastes pulmonaires humains (HLFs), ont été traités avec TGFβ1 (5 μg/ml) suivi par la mesure du niveau d'expression de gènes HuR, α-SMA, collagène (COL1A1 et COL3A1) et fibronectine (FN1). Nous avons observé par PCR quantitative (qPCR) et par western blot que le traitement des cellules HLFs par TGFβ1 augmentait l'expression d'α-SMA, collagène et fibronectine. Cependant, TGFβ1 n'avait pas d'impact significatif sur le niveau d'expression de HuR. Ensuite, nous avons montré par immunofluorescence que TGFßl induit la translocation de HuR vers le cytoplasme - une caractéristique indicative de son activation. Pour vérifier maintenant si HuR est nécessairepour la différenciation des fibroblastes en myofibroblastes les HLFs ont été transfectées avec des petits ARN interférents (pARNi) dirigés contre HuR (siHuR) suivi par traitement avec TGFβ1. Nos résultats ont montré que les cellules transfectées avec siHuR expriment moins d'α-SMA en comparant avec les cellules transfectées avec pARNi control (pictrl). Cependant, HuR avait peu d'effet sur le niveau d'expression de COL1A1, COL3A1 et fibronectine. Ensuite, les expériences de stabilité ont montré HuR ne semble pas réguler la stabilité de ces ARNm. Dans le but de répondre à la deuxième question, nous avons réalisé une expérience d'immunoprécipitation de l'ARN (RIP). Nos résultats ont montré que le traitement des HLFs par TGFβ1 enrichie la liaison de HuR aux ARNm d'α-SMA, COL1A1, COL3A1. Cependant, TGFβ1 n'induisait pas la liaison de HuR sur l'ARNm de FN1. Cette étude est la première à étudier le rôle de HuR dans la différenciation des fibroblastes en myofibroblastes et la production de matrice extracellulaire. Ces résultats constituent la base pour d'autres études visant à étudier le rôle de HuR dans la pathogenèse de l'IPF. Ceci pourrait contribuer au développement d'une nouvelle stratégie thérapeutique ciblant les maladies fibrotiques ; telles que la FPI