Dynamic remodeling of membranes and their lipids for cholesterol transport during steroid biosynthesis in Leydig cells

Cholesterol is the only precursor for all steroids produced in mammals. During hormone induced acute steroidogenesis, large quantities of cholesterol is trafficked from its intracellular stores to the cholesterol-poor organelles, mitochondria, to be converted to pregnenolone, the first of all steroids. Although steroidogenesis is extensively studied, the actual source organelle that stores and then mobilizes cholesterol for utilization in steroid production and the pathway that assists this hydrophobic molecule to be trafficked to mitochondria are yet to be determined. Utilizing the domain 4 (D4) of the Perfringolysin O protein produced by Clostridium perfringens, which binds to high concentrations of cholesterol in membranes without cytotoxicity, we first determined the source organelle. Live cell imagining analysis in a Leydig tumor cell line and primary rat Leydig cells utilizing mCherry tagged D4 revealed release of a pool of cholesterol from the plasma membrane within 30 minutes of hormonal stimulation. Thus leading us to conclude that the bulk of steroidogenic cholesterol destined for mitochondria originates from the plasma membrane during acute steroidogenesis. Further we identified a pregnenolone mediated feedback mechanism that stops excessive cholesterol movement from the plasma membrane and thus protects mitochondria from cholesterol-induced toxicity. We also investigated possible trafficking pathways. A hydrophobic cholesterol molecule from the plasma membrane needs to traverse the aqueous milieu to reach the mitochondria for steroid production. Many pathways have been proposed to assist cholesterol in this endeavor, but a precise mechanism that facilitates rapid movement of large quantities of cholesterol to the mitochondria had yet to be determined. Previous studies showing an increased interaction between the endoplasmic reticulum and mitochondria during acute steroidogenesis, led us to hypothesize that cholesterol from the plasma membrane enters the endoplasmic reticulum via a membrane association and thus reaches mitochondria by plasma membrane – endoplasmic reticulum – mitochondria associations called as PAMs. These membrane associations and cellular signals are facilitated by a variety of lipid classes. Hence, we addressed this hypothesis by subcellular fractionation of hormonally induced and also hormonally induced but steroidogenesis-inhibited MA-10 cells subjected to lipidomics analysis utilizing mass spectrometry. The results obtained from this study further supported the notion that PAMs are the route for cholesterol movement from plasma membrane to the mitochondria. Further, we also noted a dynamic reorganization of multiple lipid classes that facilitate the membrane associations and cellular signals.Le cholestérol est le seul précurseur pour tous les stéroïdes produits chez les mammifères. Au cours de la stéroïdogenèse aiguë, induite par des hormones, de grandes quantités de cholestérol sont relocalisées des réservoirs intracellulaires vers les organites cellulaires pauvres en cholestérol, les mitochondries. Le cholestérol y sera converti d'abord en prégnénolone, le premier de tous les stéroïdes à être synthétisé. Bien que la stéroïdogenèse soit largement étudiée, l'organite cellulaire source qui emmagasine et mobilise le cholestérol pour la production de stéroïdes ainsi que la voie de transport qui permet au cholestérol, cette molécule hydrophobe, d'être transporté jusqu'aux mitochondries n'ont pas encore été déterminés.Nous avons pu déterminé l'organite cellulaire source, en utilisant le domaine 4 (D4) de la protéine Perfringolysine O, produite par Clostridium perfringens. Le D4 se lie à des concentrations élevées de cholestérol dans les membranes, sans causer de cytotoxicité. L'analyse d'imagerie de cellules vivantes dans une lignée cellulaire tumorale de Leydig et des cellules primaires de Leydig de rat, en utilisant le D4 marqué au mCherry, a révélé la libération d'un pool de cholestérol à partir de la membrane plasmique dans les 30 minutes suivant la stimulation hormonale. Ceci nous mène à conclure que la majeure partie du cholestérol stéroïdien, destinée aux mitochondries, provient de la membrane plasmique pendant la stéroïdogenèse aiguë. En outre, nous avons identifié un mécanisme de rétroaction à la prégnénolone qui arrête le transport excessif du cholestérol à partir de la membrane plasmique et protège ainsi les mitochondries de la toxicité induite par le cholestérol.Nous avons également étudié les voies possibles du transport du cholestérol. Une molécule hydrophobe de cholestérol, située dans la membrane plasmique, doit traverser le milieu aqueux pour atteindre les mitochondries pour la production de stéroïdes. De nombreuses voies ont été proposées pour aider le cholestérol dans cette entreprise, mais un mécanisme précis qui facilite le mouvement rapide de grandes quantités de cholestérol vers les mitochondries n'a pas encore été déterminé. Des études antérieures montrant une interaction accrue entre le réticulum endoplasmique et les mitochondries, pendant la stéroïdogenèse aiguë, nous ont amené à émettre l'hypothèse suivante; le cholestérol de la membrane plasmique entre dans le réticulum endoplasmique via une association membranaire et atteint ainsi les mitochondries par la membrane plasmique - réticulum endoplasmique - les associations de mitochondries appelées PAM. Ces associations de membranes et signaux cellulaires sont facilités par une variété de classes de lipides. Par conséquent, nous avons vérifié cette hypothèse par l'analyse lipidomique utilisant la spectrométrie de masse. Plus précisément, nous avons comparé les différents lipides retrouvés dans les fractions sous-cellulaires de cellules MA-10 induites hormonalement vs ceux retrouvés dans les fractions sous-cellulaires de MA-10 induites hormonalement mais dont la stéroïdogenèse avait été inhibée. Les résultats obtenus à partir de cette étude ont également soutenu l'idée que les PAM sont la voie du transport du cholestérol de la membrane plasmatique vers les mitochondries. En outre, nous avons également noté une réorganisation dynamique de multiples classes de lipides qui facilitent les associations de membranes et les signaux cellulaires