The Rational Evaluation of Phage Therapy

Ten million people are projected to die in 2050 due to antibiotic résistance: that is more than the entire current population of Switzerland. Alarm was first voiced of the dangers of bacterial résistance shortly after their introduction into clinical practice, and the world is now up-in-arms about exactly what to do. The purpose of this doctoral study was to evaluate bacteriophage therapy as a potential alternative treatment to antibiotics, with a specific focus on determining the phage composition of commercially- available products and assessing phage susceptibility in vancomycin-resistant Staphylococcus aureus. This therapy, which harnesses the lytic cycle of naturally-occurring bacterial viruses (referred to as phages), has been used in Eastern European countries for clinical treatment for over 50 years. The renewed interest phage therapy has received since 2000 is presented in the first chapter to provide a meta-analysis of the accomplishments and short-comings of current efforts, as well as highlight certain factors that have deterred its broader application. Several reported case studies have used phage products from Georgia, where they are sold as over-the-counter medicines. A second focus of this work was to understand how these phage products are composed by using metagenomics to study the composition of ten products. This high-throughput technique identifïed which phage généra have been selected as therapeutic candidates against différent bacterial hosts, as well as characterized the genetic safety of this self-amplifying therapy. A closely-related group of Kayviruses was the sole phage component against S. aureus, except for one product, which included a P68-like phage that targets specific bacterial strains. Evaluating the in vitro activity of these products against S. aureus led to the discovery of increased phage insensitivity for strains also displaying intermediate levels of résistance to vancomycin (VISA), the last- resort antibiotic for S. aureus infections. This observation initiated a thorough investigation to identify the several, multifactorial molecular mechanisms and genetic mutations responsible for this correlated résistance. Phage infection of VISA strains is interrupted between ejection of phage DNA into the host and intracellular replication and is caused by mutations in genes involved with cell-wall composition, surface charge, metabolism, and protein synthesis. If phage therapy has the capacity to abate the antibiotic résistance crisis, then there is much to be learned from how it is currently used in countries such Russia, Georgia, and Poland. S. aureus is a frequently targeted pathogen for phage therapy and this study revealed that it may be more effective to use phage as a treatment option prior to the development of résistance to vancomycin. -- Les prévisions de santé publique suggèrent que la résistance bactérienne aux antibiotiques pourrait coûter dix millions de vies d'ici 2050 : un nombre de victimes supérieur à la population suisse. Les risques posés par l'émergence de bactéries résistantes ont été soulevés déjà très tôt après l'introduction de la pénicilline en pratique clinique, dès la fin des années 1940. Nous payons maintenant le résultat de l'utilisation démesurée de ces médicaments, qui est responsable de l'explosion actuelle de l'antibiorésistance. Le but de la présente thèse est l'étude d'une stratégie thérapeutique alternative contre les bactéries résistantes par l'utilisation des bactériophages, ou phagothérapie. Les bactériophages (phages) sont des virus prédateurs spécifiques des bactéries, dans lesquelles ils injectent leur matériel génétique et parasitent l'appareillage de synthèse pour se reproduire. A la fin de leur cycle reproductif, ils tuent l'hôte et le font éclater pour relâcher les nouveaux virions. La phagothérapie tire parti des propriétés bactéricides des phages pour traiter les infections. La phagothérapie a été utilisée depuis plus d'un demi-siècle, entre autre par les forces de l'Axe durant la seconde guerre mondiale, puis dans les pays de l'ex-URSS. Cependant, les critères de production des phages, le contenu des préparations et leur efficacité contre les bactéries résistantes ne sont en général pas bien déterminés. Le présent travail s'est intéressé à la faisabilité de la phagothérapie en terme de qualité et d'efficacité. Le premier chapitre revoit les fondements et les développements récents de cette stratégie antimicrobienne, pour laquelle un engouement nouveau existe dans les pays industrialisés depuis une décennie. Ce chapitre revoit la méthodologie et les résultats des essais cliniques récents, la plupart non contrôlés, et soulève les questions fondamentales qui doivent être abordées avant de pouvoir appliquer définitivement ce type de traitement dans les pays occidentaux. Le second chapitre décrit le développement et les résultats de techniques génomiques modernes, par la métagénomique, permettant d'analyser le contenu en phages de préparations vendues sans ordonnances médicales dans les pays de l'ex-URSS. Les résultats, originaux, permettent d'une part de décrire les phages utilisés au niveau génomique, d'autre part de connaître les contenus en phages de ces préparations, ainsi que l'évolution de ces contenus qui ne sont souvent pas parfaitement connus, et enfin de faire l'inventaire de gènes potentiellement dangereux que ces préparations pourraient contenir, tels que des gènes de résistance aux antibiotiques ou des gènes de virulence qui pourraient être transmis à la flore microbienne des patients par le traitement. Ce type de méthodologie deviendra certainement une étape obligatoire de la production de phages thérapeutiques dans les pays occidentaux. Le troisième chapitre s'intéresse à l'activité de phages anti-staphylococciques de ces préparations sur des collections de Staphylocoques dorés sensibles ou résistants aux antibiotiques disponibles en clinique, y compris à la vancomycine, considérée comme agent antimicrobien de dernier ressort. Les résultats montrent que lesdits phages sont en général efficaces contre toutes les souches antibio-sensibles, mais perdent leur efficacité contre la plupart des souches de sensibilité diminuée à la vancomycine, appelées « Vancomycin-Intermediate Slapbylococcus aureus » ou VISA. L'étude des mécanismes de résistance aux niveaux moléculaires et génétiques indique que cette perte d'efficacité résulte de l'addition de plusieurs dérèglements de la cellule, induits par la résistance à la vancomycine. Les altérations se situent aux niveaux (i) de la structure de la paroi cellulaire, au travers de laquelle les phages doivent injecter leur ADN, (ii) de la membrane plasmique, dont les phages utilisent le potentiel de membrane pour faire entrer l'ADN dans la cellule, et (iii) de l'appareil de transcription du RNA, que les phages utilisent pour transcrire leurs gènes. Parmi toutes ces altérations, aucune mutation unique ne semble pouvoir conférer la résistance aux phages. Deux au minimum sont nécessaires. Enfin, une étude complémentaire sur une grande collection de souches cliniques de France a confirmé le fait que les VISA étaient statistiquement plus souvent résistants aux phages que les staphylocoques sensibles, et que ceci devra être pris en compte pour les traitements futurs d'infections à Staphylocoques dorés par la phagothérapie. En conclusion, la phagothérapie est une stratégie antimicrobienne largement utilisée dans les pays de l'ex- URSS tels que la Russie, la Georgia, et la Pologne. Elle a un potentiel certain pour cibler les infections problématiques telles que celles dues à des bactéries résistantes. Mais elle doit être étudiée soigneusement, aussi bien au niveau de la production que de l'efficacité, comme le montre la résistance inattendue des VISA aux phages. La connaissance précise de ces nouveaux agents antimicrobiens et de leur interaction avec les agents pathogènes est un prérequis indispensable à leur utilisation future dans les pays occidentaux